Материал: (никита)KUL_T_KL_EKZAMEN

32. Влияние условий культивирования на жизнедеятельность микроорганизмов.

Все факторы внешней среды, оказывающие большое влияние на развитие микроорганизмов, можно разделить на три основные группы: физические, химические и биологические. Из физических факторов наиболее важное значение имеют влажность, концентрация веществ, температура, радиация, свет; из химических - реакция среды и окислительно-восстановительные условия в ней; из биологических - антимикробные вещества. Необходимо помнить, что существует тесная взаимосвязь между многими факторами окружающей среды и что изменение одного из них часто меняет реакцию микроорганизма на действие других факторов.

Физические факторы

Влажность. В клетках микроорганизмов протекает множество различных биохимических процессов. Вода же является той необходимой средой, в которой только и могут осуществляться все эти химические реакции. Микробная клетка на 65-85 % состоит из воды, и вся ее жизнедеятельность связана с наличием влаги.

Концентрация веществ. Высокие концентрации любых веществ, в том числе питательных, создают высокое осмотическое давление во внешней среде, превышающее внутреннее осмотическое давление в клетке. Вода при этом выходит наружу, клетки обезвоживаются и начинается плазмолиз. Из-за невозможности поступления в микробную клетку питательных веществ, прекращается нормальный обмен с внешней средой.

Температура. Как и все факторы внешней среды, температурная зависимость характеризуется тремя кардинальными точками (минимум, оптимум, максимум), которые различны для отдельных микроорганизмов. Все микроорганизмы по их отношению к температуре делят на три основные группы: психрофилы, мезофилы и термофилы.

Температурный оптимум психрофилов находится в пределах 0-15 °С (представители микрофлоры северных морей). Для психрофилов характерна небольшая скорость роста. К мезофилам относится большинство используемых в промышленности бактериальных и грибных культур микроорганизмов, температурный оптимум развития которых находится в пределах 25-37 °С. К термофильным микроорганизмам относятся формы, температурный оптимум которых 50-60 °С, крайние пределы 30-70 °С. Термофильные микроорганизмы представляют особый интерес для промышленного использования, так как культивирование их при высоких температурах создает селективные условия и позволяет снизить требования к стерильности процесса.

Высокие и низкие температуры неодинаково влияют на микроорганизмы. Наиболее губительны для них высокие температуры, вызывающие коагуляцию белков клетки и нарушение активности ферментов. При повышении температурного максимума жизнедеятельность микроорганизмов резко снижается.

Химические факторы

Концентрация ионов водорода (pH). Каждый микроорганизм имеет свой максимум и минимум pH, в пределах которых он может развиваться.

Бактериальные микроорганизмы хорошо развиваются при pH, близком к нейтральному - от 6,5 до 7,5. У микроскопических грибов и различных видов дрожжей оптимум pH в кислой зоне - от 4 до 6.

Окислительно-восстановительный потенциал. Выражают через rH2. Если pH выражает степень кислотности и щелочности, то rH2 - степень аэробности.

Шкала от 0 до 41 характеризует любую степень аэробности. По отношению к этому фактору внешней среды все микроорганизмы подразделяются на следующие основные группы: аэробы, анаэробы и факультативные анаэробы. Аэробы содержат в своих клетках систему дыхательных ферментов и в качестве акцепторов водорода при окислительно-восстановительных процессах используют молекулярный кислород. Анаэробы получают энергию без участия кислорода воздуха за счет сопряженного окисления - восстановления веществ субстрата. Для представителей этой группы микроорганизмов молекулярный кислород не только не нужен, но в ряде случаев и ядовит.

Микроорганизмы, для которых кислород не обязателен, так как они живут за счет сопряженного окисления-восстановления без вовлечения кислорода, называются факультативными анаэробами. Они живут в широком диапазоне rH2 - от 0 до 30. Кислород для них не ядовит или слабо ядовит.

33. Потребность в кислороде и аэрация. Культивирование анаэробных микроорганизмов.

Для роста и развития аэробных микроорганизмов необходим кислород. Он окисляет органические субстраты и обеспечивает клетки энергией. В отличие от других питательных веществ кислород очень плохо растворяется в воде и в растворах солей. Растворимость кислорода в ферментационных жидкостях обычно составляет не более 4—7 мг/л. Такое количество кислорода обеспечивает потребность культуры в течение нескольких минут, поэтому при культивировании аэробных микроорганизмов обязательным условием является аэрация культуральной жидкости. При аэрации происходит непрерывный транспорт кислорода из газовой фазы в жидкую к клеткам микроорганизмов, а также отвод от них образующегося диоксида углерода. Потребность культуры микроорганизмов в кислороде зависит от ряда факторов, в частности от концентрации микроорганизмов в культуральной жидкости, вида используемого углеродсодержащего субстрата, вида и штамма применяемых микроорганизмов.

Культивирование анаэробных микроорганизмов более сложно, чем выращивание аэробов, так как здесь должен быть сведен до минимума контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом. Для создания анаэробных условий используют различные приемы. Их подразделяют на физические, химические и биологические. Все они основаны на том, что микроорганизмы культивируют в каком-то замкнутом пространстве.

К физическим методам создания анаэробных условий относится культивирование в микроанаэростате – вакуумном аппарате для выращивания микроорганизмов, в котором воздух замещен газовой смесью. Наиболее часто используемая смесь имеет следующий состав: азот с 5 % СО₂ и 10 % Н₂.

К химическим методам относится:

1) Использование химических веществ, поглощающих молекулярный кислород. В качестве поглотителей молекулярного кислорода в лабораторной практике используют щелочной раствор пирогаллола, дитионит натрия (Na₂S₂O₄), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реактивы.

2) Использование восстанавливающих агентов, которые добавляют в большинство сред для снижения окислительно-восстановительного потенциала среды: тиогликолат натрия, цистеин, аскорбиновая кислота.

Как пример биологического способа создания анаэробных условий - выращивание совместно с аэробными или факультативно-анаэробными бактериями. Например, питательную среду в чашке Петри разделяют желобком на две половины, на одну половину засевают какой-либо аэробный микроорганизм, на другой – анаэроб. Края чашки заливают парафином. Рост анаэробного микроорганизма начнется только после полного использования кислорода аэробом.

Для культивирования анаэробных бактерий используют и другие методы, ограничивающие доступ воздуха к растущей культуре: выращивание в высоком слое среды; выращивание в толще плотной среды; заливка среды с посевом высоким слоем стерильного вазелинового масла или парафина.

34. Динамика роста культуры микроорганизмов и характерные особенности каждой фазы.

При внесении микроорганизмов в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока содержание питательных веществ не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Процесс роста и размножения микроорганизмов в такой системе описывается кривой роста , которая имеет S-образную форму.

1 – лаг фаза (фаза адаптации). Внесенные в питательную среду клетки микроорганизмов приспосабливаются к условиям и составу среды, размножения практически не происходит. Продолжительность этой фазы (может длиться от нескольких часов до нескольких суток) зависит от состава питательной среды, рН, температуры, возраста и количества внесенных клеток

П – логарифмическая или экспоненциальная фаза роста. Это стадия интенсивного размножения. Скорость размножения максимальна. В этой фазе большинство клеток является биологически активными и молодыми. Если культуру в данной фазе развития перенести в другую емкость с аналогичным субстратом, то скорость роста микроорганизмов не изменится. В этом случае лаг-фаза отсутствует. Если же пересев происходит во время другой стадии, то фаза адаптации обязательно будет присутствовать. Клетки по размеру мелкие, так как почкование опережает рост, но большая поверхность таких клеток обеспечивает высокую скорость биохимических процессов. На этой стадии культура более чувствительна к действию неблагоприятных факторов.

Биологические факторы (антимикробные вещества)

Наиболее известными антимикробными веществами являются антибиотики, которые даже в небольших концентрациях угнетают рост и активность микробов. Антибиотики образуют главным образом актиномицеты, а также некоторые грибы и бактерии. Механизм действия антибиотиков состоит в том, что одни из них нарушают процессы деления бактериальной клетки, другие изменяют отдельные процессы метаболизма, мешают использованию витаминов, конкурируют с отдельными ферментами, нарушают процессы дыхания, способствуют образованию перекисей, лизису клеток, оказывают депрессирующее действие на поверхностное натяжение и т. д.

Ш фаза - замедленного роста. Скорость размножения замедляется, так как постепенно изменяется состав среды: снижается концентрация питательных веществ, увеличивается плотность культуры в единице объема, накапливаются продукты обмена веществ клеток, которые в определенной концентрации могут угнетать нормальную жизнедеятельность культуры микроорганизмов.

IV фаза – стационарная. Наступает, когда концентрация клеток перестает увеличиваться и число их в единице объема становится максимальным. Скорость размножения равна скорости отмирания. В этот период в результате жизнедеятельности клеток в культуральной среде накапливаются продукты обмена веществ, которые имеют важное практическое значение (ферменты, антибиотики и др.).

V фаза - отмирания. Это период, когда в результате истощения питательной среды и максимального накопления продуктов обмена скорость отмирания клеток намного превышает скорость их размножения. Происходит автолиз — распад белков мертвых клеток под действием собственных ферментов. Фаза отмирания является противоположностью логарифмической фазы роста.

35. Параметры роста: скорость роста, урожай клеток, время генерации, длительность лаг-фазы, экономический и метаболический коэффициенты и др.

Урожай. Под урожаем понимают разность между максимальной и исходной массой бактерий: X = Х_макс - Х₀. Эту величину выражают в граммах сухого вещества. Особенно важное значение имеет отноше­ние урожая клеток к количеству потребленного субстрата (X/S). Если обе эти величины выражены в весовых единицах, то отношение X/S на­зывают экономическим коэффициентом и обозначают Y. 

Экономический коэффициент культивирования или выхода биомассы обозначают «Y» и определяют как отношение веса (в граммах) или числа образованных клеток к весу (в граммах) или концентрации потребленного питательного субстрата.

Y= , где   - увеличение количества биомассы, соответствующее потреблению субстрата в количестве  .

Метаболический коэффициент, удельная скорость метаболизма микроорганизмов, отнесенная к единице биомассы скорость потребления субстрата культурой. По своему физич. смыслу М.к. аналогичен ферментативной активности дрожжей и бактерий и является постоянной величиной при постоянстве термодинамич. параметров, состава окружающей среды и биомассы микроорганизмов. Тесно связан с коэффициентом размножения микроорганизмов и экономическим коэффициентом.

Скорость роста. Скорость роста биомассы – важный показатель процесса ферментации. Вид кривой роста очень похож для различных микроорганизмов, однако время ферментации существенно различается. Для быстрорастущих бактерий весь цикл может закончиться за несколько часов, а для мицелиальных микроорганизмов или изолированных клеток растений время составляет недели и месяцы.

Для описания скорости роста используется общая скорость роста Q_Х: Этот показатель не вполне отражает физиологическое состояние биомассы в процессе его роста.

Удельная скорость роста микроорганизмов, когда это необходимо рассчитывается для любой фазы развития периодической культуры, но чаще всего она определяется для фазы логарифмического роста, в которой кривая роста имеет линейный характер.

Длительность лаг-фазы (Т). Это параметр, очень важный для сужде­ния о свойствах бактерий или о пригодности среды. Его определяют как промежуток времени между моментом t_r, в который культура дос­тигла определенной плотности х_г, и моментом tj, в который она могла бы достичь такой же плотности, если бы сразу же после инокуляции на­чинался экспоненциальный рост (индекс 1 означает лаг-фазу, индекс r-реальный рост, а индекс i- идеальный рост):

Поскольку параметр Т пригоден лишь для сравнения двух культур с одинаковыми скоростями экспоненциального роста, рекомендуется из­мерять длительность лаг-фазы не в абсолютных, а в физиологических единицах (время генерации д). Разность между наблюдаемым ростом и вычисленным идеальным, выраженная числом, кратным времени гене­рации, равна L=T\v. Таким образом, величина L показывает, на сколько удвоений (генераций) реальная культура отстает от идеальной, которая с самого начала росла бы экспоненциально. Эту величину обычно ис­пользуют при сравнении данных, характеризующих влияние различных питательных веществ, ингибиторов роста и условий культивирования.

Время генерации g – время, за которое биомасса культуры удваивается.

g = t_удв. =   =