Суспензионные культуры - отдельные клетки или группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко подвергнуть воздействию химических веществ.

Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов (абсолютное увеличение количества и активности ферментов метаболизма вследствие воздействия на них определенного химического соединения, в частности лекарственного средства) и экспрессии генов (это процесс, в ходе которого наследственная информация от гена преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок), деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.

Обычно для получения суспензионной культуры используются рыхлые обводненные каллусные ткани.

Для получения культуры клеток берется наиболее жизнеспособная часть каллусной ткани, а ее количество должно быть в 15-20 раз больше в расчете на объем питательной среды, чем при серийном культивировании на агаре. При этом может использоваться питательная среда того же состава, что и для поверхностного культивирования.

Рост суспензионных культур клеток можно оценивать по одному или нескольким следующим параметрам:

1. Объем осажденных клеток. 2. Число клеток.  3. Сырая и сухая масса. 4. Содержание белка.  5. Проводимость среды. 6. Жизнеспособность клеток. 

40.Периодический, продлённый периодический, многоциклический и непрерывный процессы культивирования клеток микроорганизмов

Периодический способ культивировани. Это такой процесс, когда в ферментер со стерильной питательной средой подается посевной материал, задаются определенные технологические параметры (температура, рН, обороты мешалки) и процесс проходит самостоятельно с образованием целевого продукта. Далее в этой же емкости микроорганизмы при определенных условиях проходят через все стадии роста и развития популяции.

Когда процесс культивирования заканчивается, емкость для выращивания освобождают, и цикл возобновляется. Этот процесс экономически не выгоден, т.к. образуется мало целевого продукта. При таком способе культивирования скорость роста биомассы всегда стремится к нулю либо из-за недостатка питательных веществ, либо из-за накопления в среде токсических метаболитов. Этот способ используется для получения посевного материала на некоторых этапах, а также при микробиологическом производстве аминокислот, в производстве вакцин и т.д.

Промежуточные способы культивирования

 Продленный периодический процесс – предусматривает одноразовую загрузку и разгрузку ферментера. Однако цикл развития микроорганизмов в продленном периодическом процессе удлиняется двумя способами:

1) за счет подпитки – периодическое или непрерывное добавление питательной среды;

2) за счет длительного удержания клеток в системе (диализная культура). При этом культура развивается в пространстве, ограниченном полупроницаемой мембраной, а продукты метаболизма диффундируют во внешний раствор. В этом случае продлевается экспоненциальная фаза и фаза линейного роста. Наиболее простой диализный метод – культивирование в целлофановых мешках, погруженных в питательную среду.

Многоциклические процессы культивирования – ведут в одном ферментере, многократно повторяя полный цикл развития культуры без перерыва на стерилизацию. Применяют как для получения биомассы; для производства продуктов микробного синтеза – антибиотиков, внеклеточных ферментов, аминокислот. Применение данного способа позволяет в несколько раз сократить затраты труда на производство продукта по сравнению с периодическим способом.

Различают:1) Одностадийные многоциклические процессы – осуществляются в одном ферментере.2) Многостадийные многоциклические процессы – основаны на принципе повторного и последовательного периодического культивирования. Протекает в нескольких ферментерах, которые соединены в батарею с целью длительного использования культуры.

Непрерывный способ культивирования. При этом в процессе биосинтеза из ферментера берется определенное количество культуральной жидкости и вносится в другой ферментер, в котором тоже начинается биосинтез. Культуральная жидкость выполняет функции посевного материала. Микроорганизмы постоянно получают приток свежей стерильной питательной среды, а из аппарата непрерывно отбирается биомасса вместе с образуемыми метаболитами. Такой способ культивирования можно назвать «открытой» системой. Непрерывная ферментация может проходить в следующих системах: гомогенные системы идеального смешения, системы культивирования полного вытеснения, системы твердожидкостного типа.

41.Методы создания и биологические свойства синхронных культур микроорганизмов.

Стремление получить культуры, все клетки которых в данный мо­мент находятся в одной фазе развития, привело исследователей к разра­ботке метода синхронизации деления микроорганизмов. Этот метод по­зволяет раздельно и поэтапно изучать физиологические и биохимические процессы, протекающие на разных стадиях развития клетки. Сущность метода синхронизации заключается в том, что путем раз­личных воздействий микробная популяция искусственно приводится в однородное физиологическое состояние. Наиболее легко определяемым показателем такого состояния популяции является одновременное (син­хронное) деление почти всех клеток культуры. Синхронизации деления подвергались различные объекты: грибы, бактерии, простейшие, водоросли, а также клетки культуры ткани и т. п. 

Периодическое синхронное культивирование. Для синхронизации деления обычно применяют популяции в фазе экспоненциального роста, когда клетки наиболее однородны по продолжительности периода гене­рации.

Степень участия клеток популяции в синхронном делении называют степенью синхронизации. Она выражается значениями индекса синхрони­зации, который характеризует степень однородности популяции и позволя­ет сравнить эффективность различных синхронизирующих воздействий.

В зависимости от характера воздействия их можно раз­делить на 3 большие группы: 1) механический отбор (селективные мето­ды); 2) действие физических факторов и 3) химико-биологические воз­действия.

Методы, основанные на механическом отборе однородных по неко­торым признакам клеток из асинхронно делящейся популяции, называ­ются естественными, или селективными. Некоторые из них получили наиболее широкое распространение в микробиологических исследовани­ях, например фракционное фильтрование и дифференциальное центри­фугирование. Таким образом, первая группа методов синхронизации заключается в механическом отборе клеток из популяции в зависимости от их объема, массы или определенной формы существования, как это имеет место в случае отбора спор. Вторая группа методов связана с физическими воздействиями, также ведущими популяцию к синхронному размножению. Третья группа факторов, вызывающих синхронное размножение, ос­нована на изменениях питательной среды путем введения ингибиторов или лишения среды веществ, необходимых для деления.

42.Управляемое культивирование микроорганизмов с заданными свойствами.

Промышленное использование микроорганизмов требует получения значительного количества микробного продукта (биомассы микроорганизмов, продуцируемых ими антибиотиков, токсинов и др.). Для этого используют методы управляемого культивирования микроорганизмов. Управляемое культивирование проводят в специальном оборудовании - биореакторах, которые позволяют создавать благоприятные и равномерные условия для роста и размножения микроорганизмов, что повышает накопление их биомассы и метаболитов, сокращает время культивирования. Управляемое культивирование может быть периодическим или непрерывным, аэробным или анаэробным, поверхностным или глубинным (во всей толще жидкой питательной среды), защищенным (асептическим) или незащищенным.

Периодическое культивирование микроорганизмов – выращивание микроорганизмов в стационарных условиях (в питательной среде без непрерывного поступления нутриентов извне). В таких условиях по мере роста микроорганизмов происходит снижение количества белковых и углеводных субстратов, снижение окислительно-восстановительного потенциала и рН, что приводит к гибели культуры. Для периодического культивирования используют специальное оборудование - ферментеры, в которых осуществляют постоянное перемешивание и аэрацию (барботаж) среды. Периодически ферментер опорожняют, производят выделение и очистку продукта, после чего начинают новый цикл. Существует несколько вариантов периодического культивирования:

• продлённое периодическое культивирование, или культивирование с дробным дозированием субстрата - подпитывают культуру периодически добавляя питательные вещества;

• многоциклическое культивирование - часть культуры предыдущего цикла переносят в новую среду;

• отъемно-доливное культивирование - в середине экспоненциальной фазы роста отбирают половину культуральной жидкости, а вместо неё вносят свежую питательную среду.

Непрерывное культивирование микроорганизмов - выращивание микроорганизмов в динамических условиях (в постоянно обно­вляемой питательной среде). Проводят в специальных биореакторах - хемостатах или турбистатах, которые снабжены устройствами для поддержания температуры и рН на постоянном уровне, а также для автоматической подачи свежей питательной среды и удаления культуральной жидкости с продуктами метаболизма. Микробная популяция тем самым поддерживается необходимое время в ло­гарифмической фазе роста. Управление скоростью поступления питательных веществ в проточных биореакторах осуществляется двумя способами турбидостатным и хемостатным.

В турбидистате управление культивированием проводят путем измерения мутности выходящего потока с использованием фотоэлектрического элемента. Скорость разбавления свежей средой устанавливают в зависимости от требуемой плотнос­ти выходящей из турбидистата культуры.

В хемостатах управление культивированием проводят путем лимитирования концентрации одного из ростовых факторов в поступающей в хемостат среде (например, концентрацию глюкозы, фосфора, серы), тем самым изменяют плотность микробных клеток в единице объёма среды.

43, 44. История создания культур клеток растений. Значение работ немецких ученых х.Фехтинга, к.Рехингера, г.Габерландта. Опыты Роббинса и Котте.

Попытки культивировать изолированные клетки ткани растений делались давно, и в истории развития этого метода можно выделить несколько этапов.

I этап (1892-1902 гг.) связан с именами таких немецких исследователей, как Хаберландт, Фёхтинг, Рехингер. Они пытались культивировать в растворе сахарозы различные растительные ткани. Для сегментов стеблей одуванчика и тополя был изучен первичный каллус. Не достигнув положительных результатов, эти исследователи высказали ряд идей и гипотез, которые подтвердились позже. Так, Хаберландт выдвинул гипотезу о типотентности любой живой растительной клетки, т.е. способности клеток реализовать свой потенциал развития и давать начало образованию целого растения при определенных условиях культивирования.

II этап (1902-1922гг.) ознаменовался создание первых питательных сред для культивирования тканей животных. Эти среды были природного происхождения и содержали плазму крови и зародышевую жидкость. Попытки вырастить изолированные растительные ткани на искусственных питательных средах, содержащих растительные экстракты, оказались неудачными, так как использовались мало подходящие для проявления ростовой активности клетки и ткани высших растений.

III этап (1922-1932 гг.). Американский ученый Робинс и немецкий ученый Котте показали возможность культивирования на твердых питательных средах меристемы кончиков корня томатов и кукурузы. Однако, через определенное время растительные ткани погибали.

IV этап (1932-1940 гг.). Французский ученый Р.Готре показал возможность долгого культивирования в условиях in vitro растительных тканей за счет периодического пересеивания их на свежую питательную среду. Впоследствии с помощью этого метода многие растения были введены в культуру.

V этап (1940-1960 гг.). С открытием в 1955 г нового класса фитогормонов –цитокининов, была получена возможность стимулировать деление клеток кусочка ткани сердцевины паренхимы табака, лишенный проводящих пучков и камбия, в зависимости от концентрации и соотношения стимуляторов роста можно было усиливать деление клеток экспланта, поддерживать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез. Было установлено положительное действие натуральных экстрактов типа эндосперма кокосового ореха, каштана, кукурузы и других растений для поддержания неорганизованного клеточного роста и стимуляции процессов морфогенеза в культуре каллусных тканей и клеточных суспензий.

VI этап (1960-1975 гг.). Профессор Ноттингемского университета Э.Коккинг разработал ферментативный метод получения изолированных протопластов из корней и плодов томата и культивировать их в контролируемых условиях. Его сотрудником Пауэром было осуществлено искусственное слияние протопластов, что открыло новый путь к созданию соматических гибридов. Французский ученый Ж.Морель разработал метод микроразомножения растений в условиях in vitro с использованием меристемиди культуры и применял его для получения оздоровленного посадочного материала орхидей.

VII этап (1975 г – по настоящее время). Продолжается быстрое развитие техники in vitro, изучение биологии культивируемых объектов, разрабатываются методы электрослияния изолированных протопластов, методы мутагенеза и клеточной селекции, методы получения гаплоидных растений. С помощью методов генной инженерии разработан эффективный метод переноса генов для двудольных растений.

Таким образом, за последние десятилетия был сделан большой шаг вперед в развитии технических приемов работы с изолированными тканями и клетками растений. Однако объектом исследования, как правило, служили однодольные и двудольные травянистые растения и в редких случаях – древесные.