На практике наиболее успешное получение первичных клеток из многих тканей связано с использованием коллагеназы, приводящим к снижению размера экспланта до небольшого кластера клеток, который прикрепляется к субстрату и распластывается. Культуры первичных клеток легко получить из многих тканей. Какое-то время эти клетки экспоненциально размножаются, но затем примерно через 6 месяцев скорость роста культуры снижается, а через 10 месяцев клетки деградируют и погибают. Это наблюдается примерно после 20−50 генераций (в зависимости от возраста тканей-источников первичных клеток: из эмбриональной – 50, из взрослой – 20). На ранних стадиях клетки обладают правильным диплоидным набором хромосом.
При успешном установлении культуры первичные клетки начинают размножаться и их необходимо периодически пересевать (субкультивировать). Субкультивирование обеспечивает возможность продления существования культуры (получение линии клеток), клонирования, исследования и сохранения клеток, а также получения более однородных популяций. Главным преимуществом получения клеточных линий из первичных культур является наработка большого количества стабильного материала, пригодного для продолжительного использования.
Культивирование клеток и тканей животных к настоящему времени получило широкое распространение в различных областях исследований - от клеточной и молекулярной биологии до быстро прогрессирующих прикладных областей биотехнологии. Культуру животных тканей применяют для изучения механизмов роста и дифференцировки клеток, гистогенеза, межтканевых и межклеточных взаимодействий, обмена веществ и т. п.
Культуры животных клеток являются важными продуцентами многих биологически важных веществ. На них выращивают вирусы для их идентификации и получения вакцин. Клеточные культуры часто применяют при тестировании и изучении механизма действия лекарственных и косметических средств, пестицидов, консервантов и т. п. Методы культуры клеток нашли широкое применение для реконструкции различных тканей и органов. Так, культура клеток кожи используется для заместительной терапии при ожогах, культура клеток эндотелия - для реконструкции стенок сосудов. Способность клеток к росту в культуре привела к развитию методов клонирования, хранения и слияния клеток, что, в свою очередь, вызвало становление новой области науки - генетики соматических клеток. Органные культуры используют при изучении закономерностей развития органов, для изучения способов сохранения жизнеспособности изолированных органов, предназначенных для трансплантации.
В настоящее время практически любые клетки человека и животных могут быть введены в культуру и тем самым служить средством и объектом во многих медико-биологических исследованиях.
Наиболее часто культивируются следующие элементы:
соединительной ткани - фибробласты;
скелетной - кость и хрящи;
мышечной - скелетные, сердечные и гладкие мышцы;
эпителиальной - печень, легкие, кожа, мочевой пузырь, почки, молочная железа;
нервной - глиальные клетки и нейроны (хотя они лишены способности к пролиферации);
эндокринной системы - гипофиз, надпочечники, клетки островков Лангерганса;
различные типы опухолевых клеток.
Превращение нормальной клетки в опухолевую носит название трансформация. В медицине принято различать доброкачественные и злокачественные виды опухолей. Доброкачественные опухоли растут относительно медленно и состоят из дифференцированных клеток. Злокачественные опухоли, напротив, демонстрируют способность к быстрому росту и к метастазированию (образованию вторичных опухолей). В соответствии с происхождением опухоли различают примерно 100 различных видов опухолей.
Стадии развития опухоли:
I. Инициация. Происходит превращение нормальной клетки в опухолевую, способную постоянно делиться. Процесс деления в каждой клетке регулируется системой генов: Чтобы клетка вступила в деление, необходимо наличие в геноме фактора, который предупреждает репрессию гена-репрессора или гена-инициатора клеточного деления.
Трансформация может происходить двумя путями: мутационным и эпигеномным.
II. Промоция. Трансформированные клетки могут долгое время находиться в неактивном состоянии. Для того чтобы клетки начали делиться, требуется дополнительное влияние фактора, стимулирующего клетки к размножению. Как правило, канцерогенные вещества являются полными, т.е. вызывают и трансформацию, и промоцию. Однако в случае воздействия малой дозы канцерогена активации клеток может не произойти, и канцерогенез будет протекать в два этапа. Кроме канцерогенов, в качестве промоторов могут выступать факторы, не обладающие свойствами канцерогенов: гормоны, медиаторы пролиферации (в частности, при хроническом воспалении, заживлении после травмы).
III. Прогрессия - качественные изменения свойств опухолевой ткани, приводящие к увеличению различий между ней и исходной нормальной тканью. Основным признаком прогрессии является возрастание автономности, т.е. нерегулируемости, опухолевого роста.
Влияние опухоли на организм (их поведение) - развитие опухоли в определенных тканях приводят к утрате их функций (опухоли пищеварительной системы, легких, эндокринных желез и др.); - опухоль захватывает питательные вещества и субстраты окисления из крови (аминокислоты, глюкозу), а также выделяет токсические вещества, которые нарушают обмен веществ в организме, что приводит к развитию кахексии; - опухоли могут вызывать сдавление окружающих тканей, тем самым нарушить их функции (опухоли мозга, средостения и др.); - гормонально активные опухоли вызывают нарушения определенных органов (гипергастринемия при опухоли поджелудочной железы, гиперкортицизм при опухолях легких и др.).
Монослойные культуры
Это культуры, которые растут в один слой и если их вовремя не пересадить, то погибают. В случае монослойных культур необходимо проводить систематические пассажи клеток, используя для этого культуры предыдущего рассева или музейные клетки, сохранившиеся в условиях консервации.
Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение движения. Когда две клетки приближаются друг к другу, то в зоне контакта прекращаются специфические движения клеточной мембраны. Первичные клетки, следовательно, не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев достижение полного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений.
Большинство клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя, будучи прикрепленными к субстрату, другим клеткам или стеклу.
Монослойные культуры имеют ряд преимуществ, являющихся предпосылками их широкого использования:
1. выделение секретируемого продукта многими клетками осуществляется эффективнее в случае их прикрепления к субстрату;
2. возможность быстрой и легкой замены питательной среды; возможность сопоставления времени и количества среды с периодом роста клеток или временем наработки продукта;
3. обеспечение наибольшей гибкости исследований, поскольку в монослой могут быть введены любые типы клеток;
4. достижение искусственно высокой плотности клеток с использованием перфузионной техники;
5. возможность использования одной и той же аппаратуры с разным отношением клетки-среда, легко изменяемым в ходе эксперимента.
Однако при использовании монослойных культур выявляются и недостатки:
1. сложность масштабирования;
2. отсутствие информативности визуального анализа;
3. трудности с определением и поддержанием таких параметров, как кислотность и содержание О2 и обеспечением гомогенности культуры клеток;
4. необходимость значительных пространств.
Суспензионные культуры
Для наращивания клеточной массы удобнее использовать не монослойные, а суспензионные культуры. Как правило, клетки, отделившиеся от субстрата, на котором они росли, неспособны к росту в суспензии и быстро деградируют. Но если некоторые клетки культивировать во вращающемся флаконе (2 об/мин), не дающем возможности прикрепления клеток к поверхности, в среде, содержащей метилцеллюлозу, предотвращающую агрегацию клеток, можно получить жизнеспособные суспензионные клеточные штаммы.
Суспензионное культивирование первичных и перевиваемых клеточных линий проводят в роллерных установках или ферментерах.
Суспензионное культивирование дает, по меньшей мере, 2-3-х кратную экономию питательных сред, по сравнению с общепринятым стационарным монослойным культивированием при полном исключении дорогостоящих протеолитических ферментов и буферных растворов. Кроме того, суспензионные культуры представляются предпочтительными с точки зрения получения больших количеств биомассы.
Непроточные культуры. Обычный тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. Эти системы пригодны для культивирования клеток как в монослое, так и в суспензии. По мере роста клеток в среде культивирования происходит исчерпание питательных веществ и накопление метаболитов – следовательно, среда должна постоянно меняться, что, в свою очередь, приводит к изменению клеточного метаболизма (физиологической дифференцировке). Системы непроточных культур характеризуются в той или иной степени накоплением отходов и непостоянством внешних условий.
Способы увеличения продолжительности жизни культур:
а) прерывистый – часть культуры заменяется равным объемом свежей среды;
б) постоянный – объем культуры постоянно увеличивается с низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются;
в) перфузионный – постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной бесклеточной среды.
Проточные культуры. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Это единственная система, в которой все клетки гомогенны и сохраняют гомогенность в течение длительно периода, что имеет очень важное значение в физиологических исследованиях. Однако использование таких культур для получения клеточных продуктов невыгодно с экономической точки зрения. Системы, пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.