Качество воды, используемой для приготовления питательных сред либо для мытья культуральной посуды, имеет важное значение. До недавнего времени такая вода приготавливалась путем простой и двукратной дистилляции питьевой воды. В настоящее время наряду с традиционными широкое применение получили методы очистки воды путем использования физико-химических процессов обратного осмоса, ионного обмена и мембранной фильтрации. Водопроводная вода, используемая в качестве исходной и прошедшая в этих установках через очистку обратным осмосом, поступает на фильтры из активированного угля, с них - на колонки с ионообменными смолами и затем - на мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. При необходимости вода дополнительно подвергается воздействию мощного потока УФ облучения.
Для очистки воды подобным способом наиболее часто применяются установки типа ОВ-1, состоящие из двух конструктивно самостоятельных частей, допускающих независимое использование, – ОВ-2 и ОВ-3. Установка ОВ-2 осуществляет приготовление общелабораторной воды, превосходящей по качеству очистки дистиллированную воду. Установка ОВ-3 предназначена для получения пригодной для приготовления питательных сред сверхчистой из общелабораторной или дистиллированной воды.
Приборы и аппараты для мытья и стерилизации посуды обеспечивают выполнение всех этапов технологического процесса:
предварительную стерилизацию посуды, поступающей из опыта, насыщенным водяным паром в паровых стерилизаторах (автоклавах);
предварительное замачивание в водных растворах химических реагентов (5 % растворе гипохлорита натрия, 3 % растворе перекиси водорода и т. д.);
полоскание после замачивания холодной или слегка нагретой водой;
мытье горячим раствором детергента с низким пенообразованием;
вторичное полоскание горячей водой;
финишное полоскание дистиллированной или общелабораторной водой;
сушку в сушильных шкафах с принудительной продувкой горячим воздухом;
упаковку и финишную стерилизацию в паровых или воздушных стерилизаторах.
Оптимальным вариантом для мытья посуды является использование автоматических моечных машин («Forma Scientific», «Miele», «HotpackHeinicke»).
В практике работ с клеточными культурами постоянно возникает необходимость массового дозирования, пробоотбора или разведения биологически активных жидкостей. Для этого используются автоматические или полуавтоматические устройства, называемые в различных источниках дозаторы-дилюторы, автоматические пипетки и т. п.
Одним из основных требований к такого рода приборам является отсутствие контакта между дозируемым раствором и частями конструкции дозатора. Данным требованиям отвечают полуавтоматические и автоматические шприцевые дозаторы, которые производят разведение или дозирование одновременно по двум каналам и могут работать как в автоматическом, так и полуавтоматическом режимах.
Наиболее часто применяемый автоматический шприцевой дозатор типа «Дозатрон-4» предназначен для автоматического дозирования жидкостей в иммунологические планшеты с микрокюветами. Объем единичной дозы устанавливается в зависимости от целей эксперимента.
Пипетки лабораторные типа ПЛ-01, дозаторы пипеточные типа КДП-1 и П1 производят полуавтоматическое дозирование биологически активных жидкостей. Пипетки лабораторные ПЛ-01 поставляются в наборах из 3 моделей. Величина дозы задается пользователем в определенном диапазоне (2−20 мкл, 20−200 мкл, 200−1000 мкл). Все указанные типы устройств предполагают использование сменных наконечников, которые могут подвергаться паровой стерилизации и повторно использоваться. Описанные выше приборы позволяют работу с жидкостями, нагретыми до 40° С и имеющими вязкость, близкую к вязкости воды. Тем самым не обеспечивается дозирование питательных сред на основе агара, которые для придания им малой вязкости должны быть нагреты до температуры не менее 60о С.
В таких случаях используются приборы типа «Агар-1». Этот аппарат для разлива питательных сред, состоящий из перистальтического (перекачка жидкости) насоса-дозатора и разливочного механизма, обеспечивает автоматическое одновременное заполнение в течение 1 мин 16 стеклянных чашек Петри диаметром 100 мм, находящихся в специальных планшетах. Стерильные условия в аппарате поддерживаются путем УФ облучения его внутреннего объема.
В экспериментах также применяются устройства малой лабораторной техники, не являющиеся по своей сути дозаторами, но способные облегчить этот процесс. Это так называемые приборы «Pipet-Aid», предназначенные для пробоотбора и выдачи дозы при работе с пипетками Пастера и любыми градуированными пипетками емкостью до 75 мл. Пипетка вставляется в специальный держатель, соединенный с малогабаритным вакуумным насосом, находящимся либо непосредственно в держателе, либо автономно. Управление работой прибора производится нажатием кнопок, размещенных на держателе.
Стерилизация питательных сред, как и все другие манипуляции при работе с клеточными культурами, проводится в боксовых помещениях или в ламинар-боксах.
Боксовое помещение представляет собой изолированную комнату с несорбирующими пыль моющимися покрытиями, имеющую предбоксник и обеспеченную необходимым общим и специальным освещением, системами приточной и вытяжной вентиляции, холодным и горячим водоснабжением, а также подводами газов и сжатого воздуха.
Альтернативой боксовым помещениям, требующей меньших затрат на оборудование, являются ламинар-боксы, или стерильные рабочие места. Технически задача решается путем постоянного обдува места проведения работ ламинарным потоком. При работе с заведомо непатогенными материалами поток обеспыленного воздуха из рабочей зоны выходит непосредственно в окружающее пространство. В случае работы с потенциально патогенным материалом воздух перед выходом из рабочей зоны дополнительно фильтруется, возможность обдува оператора при этом исключена. В зависимости от устройства ламинар-бокса поток обеспыленного воздуха в рабочей зоне может быть горизонтальным, вертикальным или наклонным.
Ламинар-бокс с горизонтальным потоком обеспыленного воздуха обеспечивает очистку воздуха, подаваемого в рабочую зону, путем фильтрации на фильтрах грубой и тонкой очистки, встроенных в прибор (по мере загрязнения грубый фильтр промывается, тонкий сменяется). Прибор имеет встроенные источники освещения, УФ облучения (для стерилизации рабочей зоны в перерывах между использованием бокса) и регулятор скорости воздушного потока.
Организация ламинар-боксов с вертикальным и наклонным потоком обеспыленного воздуха аналогична организации ламинар-бокса с горизонтальным потоком, описанной выше.
Ламинар-бокс для работ с потенциально патогенными культурами имеет некоторые отличия. В приборе обеспечивается рециркуляция воздушного потока, заключающаяся в том, что воздух из рабочего объема попадает на специальный фильтр тонкой очистки, откуда часть его выходит в окружающее пространство, а остальной поток повторно проходит через фильтр тонкой очистки и вновь поступает в рабочий объем. Этим достигается невозможность выноса обрабатываемого материала в помещение. Прибор имеет встроенные источники света и УФ облучения, столешницу из нержавеющей стали. Передняя часть рабочего объема закрыта прозрачным стеклом, перемещаемым по высоте. Бокс снабжен системой регулирования скорости потока воздуха и индикаторами загрязнения фильтра тонкой очистки.
Лабораторные термостаты для культивирования клеток должны отвечать ряду специальных требований:
1) обеспечивать высокую стабильность поддержания заданной температуры;
2) создавать минимальный градиент температуры по полезному объему;
3) обладать системой быстрого восстановления температуры после кратковременного открывания полезного объема;
4) внутренний объем должен изготавливаться из биологически пассивных материалов, т. е. не влияющих на жизнедеятельность клеток и стойких к воздействию компонентов питательных сред.
Материалы и покрытия внутренних и наружных частей конструкции термостата должны позволять деконтаминацию (процесс уничтожения микроорганизмов в целях обеспечения инфекционной безопасности) водными растворами спирта ректификата и стерилизацию УФ облучением.
По своей конструкции лабораторные термостаты подразделяются на жидкостные и воздушные.
В жидкостных термостатах полезный объем окружен емкостью, наполненной дистиллированной водой, которую собственно и нагревают.
Воздушные термостаты имеют полезный объем, непосредственно контактирующий с электронагревательными элементами.
Жидкостные термостаты обеспечивают малые значения температурного градиента в камере, но имеют очень большую тепловую инерцию и поэтому длительное время вхождения в рабочий режим.
Усовершенствованные формы воздушных термостатов, ранее уступавших жидкостным по ряду основных параметров, теперь составляют значительную часть серийно выпускаемых моделей.
11. СО2-инкубаторы и аэраторы. Необходимость и значение их использования.
СО2-инкубаторы. Необходимость поддержания постоянной величины рН в питательной среде и ее минимального испарения в период инкубации клеток привела к разработке специальных приборов, аналогичных термостатам. Главным отличием является наличие систем создания и поддержания определенного состава газовой среды в полезном объеме и высокой относительной влажности в нем. Это так называемые углекислотные инкубаторы, выпускаемые фирмами «Heraues», «Hotpack», «Flow». Облигантные анаэробы – те, которые гибнут в кислороде.
Газовая среда в камерах СО2-инкубатора содержит повышенную концентрацию кислорода и углекислого газа, а в большинстве случаев только углекислого газа. Величина концентрации задается по условиям культивирования и поддерживается автоматически. В автоматических СО2-инкубаторах заданный состав газовой среды поддерживается дозированным поступлением нужного газа в поток очищенного от пыли внешнего воздуха, подаваемого во внутренний объем прибора. Другой разновидностью инкубаторов являются так называемые газо-проточные инкубаторы типа ГПИ-1, где подача нужных газов производится непрерывно, а точное процентное содержание достигается изменением скорости протока.
Аэраторы. Для обеспечения аэрации культуральной среды – снабжения кислородом − используют воздух, а также воздух, обогащенный кислородом, реже − чистый кислород. Процессы, протекающие без доступа кислорода (анаэробные), зависят от газообразных субстратов и требуют отвода газообразных продуктов жизнедеятельности. Аэраторы – основной пример функционирующих систем газоснабжения и газоотвода. Может осуществляться барботированием или перемешиванием.
Ферментёр – аппарат для глубинного выращивания (культивирования) микроорганизмов в питательной среде в условиях стерильности, интенсивного перемешивания, непрерывного продувания стерильным воздухом и постоянной температуры. В лабораторной практике ферментеры применяются для ведения научно- исследовательских работ или отработки технологии массового культивирования.
В общем случае ферментер состоит из культивационного сосуда, насосов и соединительных трубопроводов (для подачи питательной среды, газов, инокулята и отбора продукта), измерительных приборов и регуляторов, управляющих температурой среды в сосуде, ее рН, окислительно-восстановительным потенциалом и другими параметрами.
В лабораторной практике наиболее часто применяются ферментеры с емкостью сосудов от 1 до 20 л, для отработки технологий – от 30 до 400 л. Во всех случаях питательной средой заполняется не более 75 % объема сосуда. Части ферментеров, контактирующие с питательной средой (сосуды, соединительные трубопроводы, насосы и др.), изготавливаются из биологически пассивных, химически стойких материалов, позволяющих производить стерилизацию насыщенным водяным паром (качественная нержавеющая сталь, силиконовая резина).
Сосуды ферментеров имеют цилиндрическую (реже коническую) форму. В них размещены датчики температуры, рН, кислорода, а также система для аэрации питательной среды, производимой барботированием газов (подача газов снизу через барботер) через питательную среду или сочетанием продувки газов с механическим перемешиванием среды. При использовании механических мешалок их соединение с приводным двигателем производится при помощи магнитных муфт, что снижает риск загрязнения питательной среды.
Помимо механического и пневматического перемешивания используются также системы циркуляционного (гидродинамического) перемешивания направленным током жидкости по замкнутому контуру при помощи насосов. Особое внимание уделяется борьбе с избыточным пенообразованием, так как если не препятствовать этому, пена смачивает фильтры для стерилизации воздуха, что приводит к загрязнению культуры посторонней микрофлорой, уменьшению полезного объема биореактора, а также выходу пены наружу.
Контроль пенообразования осуществляется путем введения в сосуд специального датчика. Для борьбы с избыточным пенообразованием используется механическое и химическое пеногашение. При механическом пеногашении лопасти пеногасителя размещаются на валу мешалки. При химическом пеногашении в крышке сосуда предусматривается специальный ввод для реагента гашения.
Глубинный метод культивирования является более совершенным по сравнению с поверхностным. При этом микроорганизмы растут и развиваются во всем объеме питательной среды, а не только на ее поверхности. Осуществляют его, применяя жидкие питательные среды.
Совокупность остатков питательной среды, растущих в ней микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности, образующихся при глубинном культивировании, называется культуральной жидкостью.
При культивировании аэробных микроорганизмов необходимо обеспечить большую поверхность соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха, так как при глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому для обеспечения роста аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать - подводить кислород во всю толщу жидкой среды. В результате питательная среда насыщается кислородом воздуха и создаются благоприятные условия для развития аэробов.
В лабораторной практике способ глубинного культивирования реализуется путем использования специальных установок – качалок, обеспечивающих встряхивание или вращение колб и пробирок со скоростью 100-200 об/мин и более. Чем больше скорость вращения, тем больше поверхность соприкосновения среды с воздухом и выше насыщение ее кислородом. Помимо перемешивания, аэрировать питательную среду можно продуванием (барботированием) через ее толщу стерильного воздуха. Этот способ также используется в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микробиологии, где его применяют при получении микробной биомассы, в производстве антибиотиков, ферментов, витаминов, кислот.