Глубинное культивирование в ферментерах имеет ряд преимуществ по сравнению с твердофазным статическим способом:
-автоматически поддерживаются все необходимые параметры: температура, рН среды, степень аэрации, скорость работы мешалки и пр.;
-постоянный контроль содержания в культуральной среде основных элементов питания; -культуральная система периодически пополняется свежей питательной средой; -постоянно осуществляется микробиологический контроль с целью предотвращения инфицирования и гибели культур; - контроль активности роста и деления клеток; - контроль образования БАВ.
Необходимо отметить, что для получения БАВ может использоваться не только биомасса клеток, но и культуральная среда. В некоторых случаях получаются штаммы и клеточные линии, почти полностью выделяющие БАВ в культуральную среду, что значительно облегчает процесс их выделения из такого специфического вида сырья.
Различают следующие фазы ростового цикла:
1. Лаг-фаза. Внесенные в питательную среду клетки микроорганизмов приспосабливаются к условиям и составу среды, размножения практически не происходит. Продолжительность этой фазы (может длиться от нескольких часов до нескольких суток) зависит от состава питательной среды, рН, температуры, возраста и количества внесенных клеток.
Если клетки переносят с бедной среды в богатую, то питательные компоненты и время расходуются на повышение активности ферментов, необходимых для повышения активности метаболизма в целом. Если же клетки переносят с богатой среды на среду с более низким уровнем питательных веществ, то они способны немедленно, хотя и с низкой скоростью, вступить в экспоненциальную фазу роста.
2. Фаза экспоненциального роста (логарифмическая). Это стадия интенсивного размножения. Скорость размножения максимальна. В этой фазе большинство клеток является биологически активными и молодыми. Если культуру в данной фазе развития перенести в другую емкость с аналогичным субстратом, то скорость роста микроорганизмов не изменится.
Клетки по размеру мелкие, так как почкование опережает рост. В то же время на этой стадии культура более чувствительна к действию неблагоприятных факторов.
3. Фаза замедленного роста. Скорость размножения замедляется, так как постепенно изменяется состав среды: снижается концентрация питательных веществ, увеличивается плотность культуры в единице объема, накапливаются продукты обмена веществ клеток, которые в определенной концентрации могут угнетать нормальную жизнедеятельность культуры микроорганизмов.
4. Стационарная фаза. Наступает, когда концентрация клеток перестает увеличиваться и число их в единице объема становится максимальным. Скорость размножения равна скорости отмирания. В этот период в результате жизнедеятельности клеток в культуральной среде накапливаются продукты обмена веществ, которые имеют важное практическое значение (ферменты, антибиотики и др.).
5. Фаза отмирания. В результате истощения питательной среды и максимального накопления продуктов обмена скорость отмирания клеток намного превышает скорость их размножения. Наблюдается резкое уменьшение числа жизнеспособных клеток. Скорость отмирания зависит от видовых особенностей организма. Фаза отмирания является противоположностью логарифмической фазы роста.
В процессе выращивания аэробных микроорганизмов, который сопровождается подачей воздуха в ферментёр и перемешиванием среды, наблюдается сильное пенообразование. Возникновение пены в процессе биосинтеза обусловлено введением газовой фазы, а также содержанием в среде питательных субстратов, солей, продуктов метаболизма микроорганизмов и поверхностно-активных веществ (ПАВ).
В чистой воде и других химически чистых жидкостях пены не бывает. Молекулы ПАВ образуют пленки на поверхности газовых пузырей, затрудняя их коалесценцию (слияние нескольких мелких пузырьков) и разрушение. В стойких пенах длительность существования пузырька составляет 1 — 15 мин.
От эффективности способов пеногашения зависят такие технологические показатели, как выход продукции с 1 м3 культуральной жидкости и ее себестоимость.
Самопроизвольный распад монодисперсных пен (с пузырьками равных размеров) происходит равномерно. Полидисперсные пены разрушаются быстрее, но неравномерно.
Борьба с ценообразованием — одна из важных задач в микробиологическом производстве.
В настоящее время имеются разнообразные средства как для разрушения пены, так и для предупреждения ее образования. Чтобы предупредить образование пены в процессе культивирования можно удалить вспениватели из исходной питательной среды, вводя в нее адсорбенты (активный уголь, иониты), которые связывают белковые пенообразователи.
При составлении питательной среды целесообразно выбирать такие компоненты, которые имеют меньшую склонность к вспениванию. На вспениваемость некоторых питательных сред влияют не только состав, но и условия обработки: температура, длительность стерилизации и количество вносимого посевного материала. Это необходимо учитывать при отработке технологии биосинтеза. Однако полностью избежать образования пены в процессах микробиологического синтеза все же не удается.
Для регулирования уровня пены в ферментёрах применяются различные способы — химические, механические, физические и комбинированные.
К химическим средствам относятся ПАВ, которые внедряясь в стенки пузырей, становятся центрами их неустойчивости. Эффективными пеногасителями служат растительные (соевое, рапсовое, кокосовое, подсолнечное, горчичное) масла, животные (сало, рыбий жир) и минеральные жиры. Недостатком этих пеногасителей является то, что при утилизации микробными клетками сами по себе способствуют пенообразованию. Механические пеногасители представляют собой различные устройства, сбивающие пену: диски, лопасти, барабаны, располагающиеся в верхней части реактора. Более сложными приспособлениями являются сепараторы пены, которые одновременно служат для сбора биомассы, содержащейся в пенном слое. Все эти устройства, конечно же, приводят к дополнительным затратам и удорожают производство.
Всю совокупность операций по подготовке оборудования и коммуникаций с целью создания в них асептических условий можно разделить на два важнейших процесса: стерилизация внутренних полостей и герметизация всех элементов и узлов.
Культивирование по принципу хемостата – автоматическое культивирование, которое определяется скоростью разбавления, та скорость с которой подаётся субстрат. Скорость разбавления должна соответствовать скорости получения продукта. При хемостатном культивировании саморегулированная система возникает из-за: если первоначальное поступление свежей питательной среды и вымывание биомассы превышает скорость деления клеток; увеличивающая популяция начинает активнее выедать субстрат, что приводит к торможению роста культуры. Конечным итогом этих процессов является установление равновесия между скоростью роста культуры и её разбавлением. Биореактор работающий в таком режиме называется хемостатом.
Хемостатные биореакторы включают следующие конструктивные элементы: ферментер, оснащенный устройствами перемешивания и аэрирования среды, с-мой теплообмена; устройство подачи питательной среды; выпускное приспособление для оттока культуральной жидкости; систему контроля скорости протока среды, основанную на поддержании в режиме автоматического регулирования постоянного уровня или массы (объема) жидкости в емкостном аппарате.
Турбидостатные реакторы отличаются от хемостатных системой контроля скорости протока среды. Наиболее распространен контроль концентрации биомассы в реакторе, основанный на измерении светорассеяния культуральной жидкости на выходе из аппарата с помощью фотоэлемента. Также концентрация клеток может оцениваться по косвенным параметрам: рН, титруемой кислотности, убыли концентрации субстрата, приросту концентрации специфических метаболитов.
Хемостатные и турбидостатные биореакторы используют при различных скоростях разбавления среды, роста клеток. Хемостатный режим культивирования эффективен при малых скоростях протока, когда концентрация клеток незначительно изменяется даже при относительно больших перепадах концентрации в среде лимитируемого субстрата. Турбидостатный режим применяют при высоких скоростях разбавления, когда происходит резкое изменение концентрации клеток в среде в ответ на изменение скорости протока жидкости через биореактор.
Турбидостатный метод культивирования применяют для селекции быстрорастущих видов, получения штаммов, устойчивых к антибиотикам.
Виды систем хемостат: 1.оксистат (уровень кислорода в среде), 2.нутристат (концентрация питательного субстрата), 3.термостат (поддержание температурного режима), 4. pH- стат.
Основная часть ассортимента специальной культуральной посуды предназначена для роста клеток в монослое, что определяет особые требования к свойствам поверхности и материала изделий как из стекла, так и из пластика. Для культивирования клеток обычно используют флаконы, колбы, матрасы, чашки Петри, платы, роллерные сосуды, пробирки, пипетки и т. д.
Посуда из стекла
Хотя в последние годы широко применяется пластиковая посуда одноразового использования, посуда из стекла не утратила своего значения благодаря ряду бесспорных преимуществ:
хорошие адгезионные (прикрепление клеток к субстрату) свойства поверхности, способствующие прикреплению клеток;
многократность использования;
биологическая инертность стекла ряда составов;
термостойкость и другие.
Кроме того, в экспериментах с контролируемым уровнем кислорода необходимо пользоваться именно стеклянной посудой, т. к. в пластике кислород может растворяться. Помимо этого из пластика могут экстрагироваться водорастворимые органические соединения.
Для стеклянной лабораторной и культуральной посуды на практике в основном применяются два типа составов - многощелочное и малощелочное боросиликатное стекло типа «Пирекс». Щелочесодержащие силикатные стекла имеют недостаточную термостойкость и химическую устойчивость к воде, кислотам и щелочам. Алюмоборосиликатные малощелочные стекла типа «Пирекс» характеризуются высокой устойчивостью к воде, устойчивостью к щелочным растворам и ко всем кислотам, за исключением плавиковой (фтористоводородной) и горячей фосфорной. Кроме того, стекла типа «Пирекс» обладают хорошими оптическими свойствами.
Существует также группа макропористых стекол, которые не используются для изготовления посуды, но применяются при культивировании клеток в качестве микроносителей.
Однако успех в эксперименте обеспечивается не только качеством стекла, но и степенью подготовки лабораторной посуды. Посуда для культивирования должна быть чистой физически, химически и бактериологически.
Пластиковая посуда
При работе с культурами клеток пластиковая посуда в отдельных случаях более пригодна из-за характерных особенностей некоторых клеточных линий. Такая посуда проста в использовании, т. к. выпускается в стерильном, готовом к работе виде. Стерилизация производится в процессе изготовления физическими (облучение УФ светом или гамма-лучами) или химическими (газы - окись этилена, жидкости - этиловый спирт, раствор пергидроля) способами. Пластиковая посуда производится в двух модификациях: для культивирования микроорганизмов и для культивирования клеток. Такое разделение вызвано тем, что культивируемые клетки (речь идет о монослойном культивировании) в отличие от бактериальных клеток находятся в непосредственном контакте с поверхностью сосуда, которая является для них субстратом. Клетки оседают на этой поверхности, прикрепляются и распластываются. Для улучшения адгезионных свойств поверхности из полистирола ее подвергают специальной обработке, в то время как биологическая посуда не обрабатывается.
Таким образом, одним из первых условий успешного культивирования клеток является хороший субстрат, т. е. посуда, обеспечивающая максимальную адгезию, распластывание и, следовательно, рост.