Основной состав питательных сред:
Источники энергии – глюкоза, глютамин, фруктоза, галактоза, уридин и цитидин.
Аминокислоты. Для культивирования клеток незаменимыми считаются 13 аминокислот (аргинин, цистин, глутамин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, тирозин, валин). Потребность в них снижается, если в среде содержится достаточно заменимых аминокислот (аланин, аспарагин, аспарагиновая кислота, пролин, глицин, серин). Важное значение имеет баланс между аминокислотами.
Витамины. Для многих культивируемых клеток необходимы водорастворимые витамины (биотин, фолиевая кислота, никотинамид, пантотеновая кислота, пиридоксин, рибофлавин и тиамин). Например, аскорбиновая кислота увеличивает урожай интерферона при его получении из культур клеток человека на микроносителе. Информация о влиянии жирорастворимых витаминов (А, D, Е, К и др.) на культивируемые клетки весьма ограничена.
Неорганические ионы. Клеткам животных для роста требуется натрий, калий, кальций, магний, фосфат, бикарбонат, хлорид. Они необходимы для поддержания осмотического давления; создания потенциалов у мембран; регулирования рН (за счет буферности); способствуют прикреплению клеток к различным поверхностям; действуют как кофакторы для энзиматических реакций; от соотношения различных ионов, особенно ионов натрия и калия, зависит урожай клеток и скорость их роста.
Следовые элементы. Считают, что для животных клеток незаменимыми или полезными являются 15 элементов: Со, Сu, I, Fe, Mn, Mo, Zn, Se, Cr, Ni, V, As, Si, Sn. Следовые элементы переходят в среды из химических соединений или из стекла (колбы, бутыли).
Липиды. Источник липидов – сыворотка. Она содержит белки, транспортирующие липиды: альбумин – переносит свободные жирные кислоты, и липопротеины – транспортируют фосфолипиды, триглицериды и холестерол.
рН и буферные растворы. Оптимальное значение рН для максимального роста клеток – 6,9-7,8.
Газы. Кислород – незаменимый элемент для роста клеток млекопитающих. Потребность в нем обеспечивают путем обдувания поверхности среды воздухом или смесью, содержащей 95% воздуха и 5% СО2. Двуокись углерода – растворяется в воде, служит источником бикарбоната. Для некоторых клеток оптимальна газовая смесь, содержащая 0,5-2,0% СО2.
Антибиотики. Наиболее часто применяют антибактериальные агенты – пенициллин, стрептомицин, гентамицин; противогрибковые агенты – амфотерицин, нистатин. Постоянное применение антибиотиков не желательно из-за выработки резистентных микроорганизмов; отрицательного влияния на рост и функции клеток; снижения урожайности, скорости роста и сохраняемости клеток.
Неопределенные добавки – сыворотки эмбриона теленка, новорожденных телят и лошадей. Функции сыворотки: является носителем для лабильных или нерастворимых в воде питательных веществ; связывает или нейтрализует токсины; содержит ингибиторы протеазы, которая инактивирует трипсин; способствует прикреплению клеток к субстрату; является источником незаменимых низкомолекулярных питательных веществ, гормонов и пептидных факторов роста; обладает защитным эффектом (например, при перемешивании).
Оптимизация состава питательных сред для культур животных клеток развивалась в двух направлениях – разработка сред, требующих внесения природных добавок (сыворотки, эмбриональные экстракты и др.), и создание сред химически определенного состава.
В настоящее время наиболее широко применяются среды, содержащие источники энергии (углеводы) и азота; незаменимые аминокислоты; витамины; неорганические соли – источники макро- и микроэлементов, включая селенит; нуклеозиды; жиры и жирорастворимые компоненты; гормоны (инсулин, трансферрин, глюкокортикоиды, эстроген, андроген, тироксин, трииодтиронин); ростовые факторы (фактор роста, синтезируемый тромбоцитами, фактор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса), а также сыворотку (до 10 %) и в ряде случаев некоторые другие добавки (бактопептон, триптозофосфат и т. п.).
Сыворотка –сложная смесь мелких и крупных молекул, способных вызывать и тормозить рост клеток.
Функции сыворотки: является носителем для лабильных или нерастворимых в воде питательных веществ; связывает или нейтрализует токсины; содержит ингибиторы протеазы, которая инактивирует трипсин; способствует прикреплению клеток к субстрату; является источником незаменимых низкомолекулярных питательных веществ, гормонов и пептидных факторов роста; обладает защитным эффектом (например, при перемешивании).
При использовании сыворотки возникают следующие проблемы: вариабельность состава; высокая стоимость и периодическая дефицитность; источник контаминации(заражение) микоплазмами, бактериофагами, вирусами и др.; источник токсинов; модифицирование поверхности клеток вследствие адсорбции или внедрения сывороточных белков; невозможность точно определить питательность среды; осложнения при очистке продуктов; чрезмерный рост фибробластов в первичных культурах других типов клеток.
В настоящее время предпринимаются попытки создания и применения бессывороточных питательных сред, в которых сыворотка заменяется смесью гормонов (инсулин, трансферрин, глюкокортикоиды и др.) и ростовых факторов. Эти среды необходимы, если по условиям эксперимента требуется избежать присутствия чужеродного белка и из-за высокой стоимости эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Однако в настоящее время бессывороточная среда имеет существенные недостатки: добавление в дешевую среду гормонов и факторов роста делает ее такой же дорогой, как среда с сывороткой. Кроме того, чаще всего бессывороточные среды пригодны для ограниченного числа клеток.
До сих пор нет общего мнения относительно роли сыворотки в клеточных культурах, как нет и общего мнения относительно физиологической роли некоторых ее компонентов. Считается, что сыворотка обеспечивает клетки гормональными факторами, стимулирующими их рост и функции, служит источником низкомолекулярных соединений, требующихся клеткам в очень малых дозах и переносимых сывороточными белками, а также обеспечивает клетки незаменимыми соединениями.
Стандартные среды для введения культур животных клеток
1. Среда Игла: содержит мин. в-ва, АК (13 незаменимых), 6 водорастворимых витаминов, холин, инозит. Используется только с сывороткой, т.к. в ней отсутствуют биотин, витамин В12, ионы железа и микроэлементы.
2. Среда Дульбекко: содержит двойную концентрацию АК, глицин, железо. Основа для бессывороточных сред.
3. Среда Искова: содержит незаменимые АК, биотин, витамин В12. Среда быссывороточная. Используется для культивирования лимфоцитов и кроветворных клеток.
4. Среда МакКоя: в присутствии сыворотки (культивирование лейкоцитов, гибридом)
5. Среда 199: без добавок – поддерживание для первичных клеток. С сывороткой – ростовая среда для быстрого размножения клеток.
При внесении микроорганизмов в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока содержание питательных веществ не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Процесс роста и размножения микроорганизмов в такой системе описывается кривой роста, которая имеет S-образную форму.
При изучении динамики роста культур микроорганизмов необходимо строго соблюдать некоторые условия: жизнеспособность засева; наличие в среде культивирования всех необходимых питательных веществ; отсутствие в среде ингибиторов, подавляющих рост клеток; поддержание в среде оптимальными всех физико-химических условий.
1. Лаг-фаза. Внесенные в питательную среду клетки микроорганизмов приспосабливаются к условиям и составу среды, размножения практически не происходит. Продолжительность этой фазы (может длиться от нескольких часов до нескольких суток) зависит от состава питательной среды, рН, температуры, возраста и количества внесенных клеток.
Если клетки переносят с бедной среды в богатую, то питательные компоненты и время расходуются на повышение активности ферментов, необходимых для повышения активности метаболизма в целом. Если же клетки переносят с богатой среды на среду с более низким уровнем питательных веществ, то они способны немедленно, хотя и с низкой скоростью, вступить в экспоненциальную фазу роста.
2. Фаза экспоненциального роста (логарифмическая). Это стадия интенсивного размножения. Скорость размножения максимальна. В этой фазе большинство клеток является биологически активными и молодыми. Если культуру в данной фазе развития перенести в другую емкость с аналогичным субстратом, то скорость роста микроорганизмов не изменится.
Клетки по размеру мелкие, так как почкование опережает рост. В то же время на этой стадии культура более чувствительна к действию неблагоприятных факторов.
3. Фаза замедленного роста. Скорость размножения замедляется, так как постепенно изменяется состав среды: снижается концентрация питательных веществ, увеличивается плотность культуры в единице объема, накапливаются продукты обмена веществ клеток, которые в определенной концентрации могут угнетать нормальную жизнедеятельность культуры микроорганизмов.
4. Стационарная фаза. Наступает, когда концентрация клеток перестает увеличиваться и число их в единице объема становится максимальным. Скорость размножения равна скорости отмирания. В этот период в результате жизнедеятельности клеток в культуральной среде накапливаются продукты обмена веществ, которые имеют важное практическое значение (ферменты, антибиотики и др.).
5. Фаза отмирания. В результате истощения питательной среды и максимального накопления продуктов обмена скорость отмирания клеток намного превышает скорость их размножения. Наблюдается резкое уменьшение числа жизнеспособных клеток. Скорость отмирания зависит от видовых особенностей организма. Фаза отмирания является противоположностью логарифмической фазы роста.
Клетки млекопитающих нуждаются в многочисленных питательных веществах, поэтому в питательную среду следует добавлять смесь аминокислот, пуринов и пиримидинов для синтеза белков и нуклеиновых кислот, глюкозу в качестве источника углерода и энергии, витамины и минеральные соли для поддержания необходимого осмотического давления и значения рН, близкого к 7,2. Среда также должна содержать небольшие концентрации антибиотиков для подавления роста бактерий и 5-20 % сыворотки (из крови человека или из плода крупного рогатого скота). Для оптимального роста температуру культуры необходимо поддерживать около 37 ºС, так как ниже 36 ºС клетки либо делятся крайне медленно, либо не делятся вовсе; при температуре выше 38 ºС погибают. Большинство культур клеток млекопитающих, в том числе и клеток человека, удается сохранять неопределенно долгое время замороженными в специальной среде при - 180 ºС.