Клеточные культуры с каждым годом находят все большее применение в самых разнообразных областях биологии, медицины и сельского хозяйства. Их используют при решении таких общебиологических проблем, как выяснение механизмов дифференцировки (возникновение различий между однородными клетками и тканями, изменения их в ходе развития особи, приводящие к формированию специализир. клеток, органов и тканей) и пролиферации (разрастание ткани организма путём размножения клеток делением); взаимодействия клеток со средой, адаптации, старения, биологической подвижности, злокачественной трансформации и многих других. Они являются исходным материалом для создания клеток-продуцентов, используются в целях повышения продуктивности сельскохозяйственных животных и для выведения новых сортов растений. Культуры клеток применяются для диагностики и лечения наследственных заболеваний, в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических веществ, а также для сохранения генофонда исчезающих видов животных и растений.
Во 2-й пол. 19 в. развитие микробиологии, прежде всего медицинской (необходимость выделения и изучения микробов, вызывающих инфекционные болезни), а также производств, основанных на процессах брожения (виноделие и др.), привело к созданию методов культивирования клеток бактерий, дрожжей и других микроорганизмов, т. е. методов их выделения, выращивания, размножения и сохранения в искусственных условиях. Клеточные и тканевые культуры позволяют исследовать такие важные для медицины проблемы, как перерождение нормальных клеток в опухолевые, всесторонне изучать их свойства, чувствительность клеток к физическим и химическим факторам, в т. ч. к лекарствам, а также определять потенциальную мутагенность и канцерогенности этих факторов, т. е. их способность вызывать мутации и опухоли. Культуры клеток насекомых дают возможность получать биологические агенты новых типов для борьбы с насекомыми-вредителями без негативного влияния на жизнеспособность полезных видов насекомых, а также не накапливающихся в окружающей среде. Достоинства биологических методов борьбы с вредителями известны уже давно, это бактериальные, грибные и вирусные препараты, получение которых требует специализированной техники и условий. Культивируемые на искусственных средах растительные клетки характеризуются большой неоднородностью; при этом возможен отбор клеток, устойчивых к тем или иным неблагоприятным факторам - засухе, низкой температуре, фитопатогенам и пр.
Современная биотехнология характеризуется использованием биологических методов для борьбы с загрязнением окружающей среды (биологическая очистка сточных вод), защита растений от вредителей и болезней, производства ценных биологически активных веществ (антибиотиков, ферментов, гормональных препаратов) для народного хозяйства. На основе микробиологического синтеза разработаны промышленные методы получения белков, аминокислот, используемых в качестве кормовых добавок. Развитие генной и клеточной инженерии позволяет целенаправленно получать ранее недоступные препараты (например, инсулин, интерферон, гормон роста человека и др.), создавать новые полезные виды микроорганизмов, сорта растений, пород животных.
Широкое распространение получили гибридомы и продуцируемые ими моноклональные (одной специфичности) антитела, используемые в качестве уникальных реагентов, диагностических и лечебных препаратов.
Биотехнологические методы направлены на получение микробной биомассы хлебопекарных дрожжей, дрожжей из мелассы, дрожжей на этанольной среде, кормовых дрожжей, кормовой биомассы из целлюлозосодержащих субстратов, микробной биомассы из природного газа, биомассы водородных бактерий, медицинских дрожжей, заквасок молочнокислых бактерий, а также на производство вакцин, бактериальных удобрений, бактериальных средств защиты растений.
С помощью клеток микроорганизмов в промышленности получают липиды, полисахариды, этиловый спирт, органические растворители, органические кислоты (уксусную кислоту и уксус, молочную кислоту, пропиленовую, лимонную, глюконовую, фумаровую и другие кислоты), витамины (группы В, D, каротиноиды), антибиотики (пенициллин, кормовой биомицин), ферментные препараты.
Микроорганизмы используют для трансформации органических соединений, защита окружающей среды, в том числе очистки сточных вод и микробиологической переработки навоза и пр. Современная биотехнология использует достижения биохимии, микробиологии, молекулярной биологии и генетики.
Использование культивируемых клеток вне организма для диагностики болезней является логическим продолжением метода биопсии, при которой изъятый из организма фрагмент ткани подвергают немедленному (преимущественно морфологическому) исследованию. Однако благодаря культивированию возможности исследования и диагностики расширяются практически беспредельно, так как имеется возможность оценки не только морфологических и биохимических изменений, но также изменений в поведении клеток, их реакций на различные агенты, в том числе на лекарственные воздействия. Воспроизведение культивируемыми клетками в ряду поколений какого-либо дефекта или изменения, свойственного клеткам in vivo, свидетельствует о наследственной природе этого дефекта или изменения.
Коррекцию функции мутантных генов и восстановление их экспрессии можно осуществить двумя путями: 1) заменой мутантного гена его нормальной копией; 2) введением нормальной копии гена при сохранности мугантной. Наиболее часто применяют второй подход генотерапевтической коррекции наследственных дефектов, что обусловлено техническими трудностями, возникающими как при удалении мутантного аллеля, так и при последующем встраивании его нормальной копии.
Для прямого переноса генетического материала в клетку используют флуоресцентно-меченную плазмидную ДНК, методику гидродинамического шока, насыщение ДНК полианионом (гепарином, декстран-сульфатом), а также ряд физических способов доставки ДНК. Среди физических методов доставки генетических конструкций в организм человека: электропорация (создание пор в бислойной липидной мембране под действием электрического поля), баллистическая трансфекция (обстреливание органов и тканей микрочастицами тяжёлых металлов, «генное ружье») и безигольное введение (бомбардировка клеток молекулами ДНК, связанными с различными металлами - Аu+, Са++). В качестве векторных систем могут быть использованы некоторые вирусы, липосомы (липидные пузырьки с включенными в них фрагментами ДНК) и катионные полимеры (полиэтиленамин, полилизин, лизин-гистидиновый полимер). Наиболее перспективными при проведении генотерапии считаются вирусные векторные системы, содержащие человеческий ген, встроенный в определенный участок генома вируса. Более чем в 80% всех генотерапевтических испытаний для доставки генетического материала были использованы именно вирусные векторы. Известно, что вирусы легко проникают в клетку, взаимодействуя с белками мембраны и клеточными рецепторами, и могут интегрироваться в ядерный геном. Наличие специфического набора поверхностных белков позволяет различным вирусам внедряться в определенный тип клеток, осуществляя тканеспецифическую экспрессию гена. Наиболее часто в качестве векторных систем используются аденовирусы, ретровирусы и лентивирусы.
Не существует универсального носителя, который обеспечил бы эффективную доставку генетического материала при всех наследственных заболеваниях. В последние годы рассматривается возможность создания невирусных носителей, представляющих собой мультифунациональные самособирающиеся комплексы с ДНК, в которых каждый компонент имеет определенную функцию по преодолению различных барьеров в организме человека.
Преимущества получения ряда фармакологических веществ из растений заключается в следующем:
• независимость от климатических, сезонных и географических условий;
• стабильность выпуска продукции в течение года;
• уменьшение площади почвы, вовлеченной в хозяйственный оборот.
На основе культуры клеток можно:
• получать известные вещества, присущие определенному растению, такие как никотин, кодеин, хинин, сапонины и др.;
• обеспечить синтез новых продуктов из трудно выращиваемых растений, например, адаптоген (лекарственное средство, преимущественно растительного происхождения, проявляющее общетонизирующие свойства, влияющие на деятельность основных органов и систем.) из корня женьшеня;
• получать новые вещества;
• использовать системы клеток для биотрансформации конечного продукта.
Для тест-объектов в основном используются животные клетки. Проверка на токсичность препарата, целенаправленное действие препарата, канцерогенность проверяют на тест-объектах.
В настоящее время существует промышленное получение ряда ценных веществ из растительной биомассы методом in vitro.
Существует несколько стандартных питательных сред, широко используемых при культивировании, но количество регуляторов роста в них варьирует в зависимости от вида растений, на выход продукта может влиять концентрация источника углерода и других компонентов среды.
Технология получения растительного сырья на основе каллусных культур имеет ряд преимуществ – это надежность и стабильность выхода биомассы и продуктов вторичного метаболизма, а также возможность использования каллусной системы для иммобилизации и последующей биотрансформации, но обладает существенным недостатком – необходимостью применения ручного труда.
Сохранение разнообразия форм жизни - важнейшая проблема современного человечества. Уже давно доказано, что устойчивость сообщества тем выше, чем больше число составляющих его видов. Поэтому сохранение биоразнообразия является единственным механизмом обеспечения стабильности жизни на Земле.
Сохранение генофонда растений в условиях in vitro. Данный приём подразумевает использование коллекций: каллусных культур растений, а также растений в пробирках и суспензионных культурах. Разработка методов культивирования клеток и тканей в условиях in vitro позволила использовать их для сохранения генофонда различных растительных объектов.
При работе с растущими коллекциями необходимо поддерживать без изменений состав питательных сред, размер пересаживаемых культур, длительность культивирования, а также условия выращивания (температуру, влажность, освещенность). Растущие коллекции постоянно оцениваются по ряду параметров (рост, жизнеспособность клеток, митотическая активность, содержание вторичных соединений и др.). Сравнение штаммов сразу по нескольким признакам может быть облегчено использованием компьютерных программ.
Депонирование коллекций растительных клеток in vitro. В настоящее время разработаны методы так называемого «депонирования» коллекций, которые позволяют существенно удлинить период между пересадками культур. Это связано с тем, что периодическое субкультивирование клеточных культур растений трудоемко и требует значительных затрат, как на выполнение работ, так и на приготовление питательных сред для культивирования.
Депонированные коллекции растительных культур могут расти без пересадок в течение 1 года и даже больше. В ряде случаев удачным является одновременное использование нескольких подходов, например, выращивание при низкой температуре и в присутствии веществ, тормозящих рост клеток.
Криосохранение и его возможности. Криосохранение – один из наиболее перспективных способов сохранения генофонда высших растений и животных. Оно позволяет хранить органы, ткани и клетки в замороженном состоянии при температуре жидкого азота (-196°С). Хранимый в этих условиях материал остается генетически стабильным и не подвержен изменениям, которые происходят с организмами при хранении обычными способами. Клетки растений являются более трудным объектом для криоконсервации, чем клетки животных.