По составу питательные среды для культивирования микроорганизмов делятся на две группы — натуральные и синтетические. Натуральные (естественные) среды состоят из продуктов животного или растительного происхождения и имеют неопределенный химический состав. К таким средам относятся овощные или фруктовые соки, животные ткани, кровь, молоко, яйца, желчь, сыворотка крови, а также отвары и экстракты, полученные из различных природных субстратов — мяса, различных частей растений, почвы. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в таких средах имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста и развития. Однако эти среды имеют сложный непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения физиологии, обмена веществ микроорганизмов. Примерами натуральных сред неопределенного состава служат мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар, картофельные среды и многие др.
К числу натуральных сред неопределенного состава относят и так называемые полусинтетические среды, в состав которых входят вещества неопределенного состава. К полусинтетическим средам относятся, например, мясо-пептонный бульон с глюкозой. К полусинтетическим средам следует относить также среды, которые содержат соединения известного состава – углеводы, нитраты, фосфаты и другие и, в незначительных количествах, соединения неопределенного состава – гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт, добавляемые в качестве факторов роста.
Питательные среды являются синтетическими, если содержат только химически чистые соединения в точно указанных концентрациях, т.е. состав их полностью известен. Достоинством таких сред являются стандартность и воспроизводимость с высокой степенью точности. Эти среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Для разработки синтетических сред необходимо знать потребности микроорганизмов в источниках питания и основные особенности их обмена веществ.
По назначению различают питательные среды общего назначения (универсальные) и специальные питательные среды.
Питательные среды общего назначения пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и могут применяться в качестве основы для приготовления специальных питательных сред. К ним относятся, например, мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, бульон Хоттингера, агар Хоттингера, сусло жидкое, сусло-агар и др.
Специальные питательные среды предназначены для избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, изучения их свойств и хранения. Различают следующие виды специальных сред: элективные (избирательные), дифференциально-диагностические (индикаторные), консервирующие.
Элективные среды. Это такие питательные среды, в которых путем добавления одного или нескольких химических соединений, создаются оптимальные условия для роста и размножения одного вида микроорганизмов и неблагоприятные – для всех остальных. Применяются для выделения чистой культуры микроорганизмов из мест их естественного обитания и для накопления массы культур. Например, питательная среда, которая представляет собой свернутую лошадиную сыворотку, является элективной средой для дифтерийных бактерий, щелочная пептонная вода – для холерных вибрионов, желчный бульон – для возбудителя брюшного тифа, печеночный бульон – для бруцелл и т.д.
Дифференциально-диагностические среды дают возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других или выявить некоторые их особенности. Примером индикаторной среды для выявления кишечной палочки в естественных субстратах может служить агарированная среда Эндо. Бактерии из рода Escherichia на этой среде образуют розовые и малиновые колонии с металлическим блеском, а бактерии рода Salmonella - бесцветные. Недостаток: при составлении учитываются характерные питательные потребности конкретного микроорганизма.
Консервирующие (транспортные) среды используются широко в клинической практике для сохранения жизнеспособности микроорганизмов в период от момента взятия биоматериала до посева. Основная цель их использования – сохранить жизнеспособность возбудителя и предотвратить размножение сопутствующей микрофлоры в период транспортировки образцов.
По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие и сухие.
Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена, а также поддержания и хранения многих микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах.
Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, реже — для накопления биомассы (например, анаэробов).
Плотные среды используют для выделения чистых культур микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, для хранения культур, количественного учета микроорганизмов, определения их антагонистических свойств и в ряде других случаев.
Сыпучие среды обычно используют для хранения посевного материала, культур-продуцентов в микробиологической и медицинской промышленности. К ним относятся, например, разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, пропитанные питательным раствором.
Сухие питательные среды представляют собой порошки или гранулы с влажностью, не превышающей 10% и легко растворимые в воде. Они выпускаются по соответствующим технологиям на производствах в различных масштабах, удобны для хранения, транспортировки и приготовления готовых к употреблению сред.
Вода – важнейший компонент всех питательных сред. Являясь хорошим растворителем, вода обеспечивает поступление питательных веществ в клетку. Она входит в состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях, например в реакциях гидролиза.
Важными элементами в питательной среде являются углерод и азот. Общеупотребительными источниками углерода и азота с повышенной питательной ценностью являются различные продукты специальной обработки мяса животных, главным образом, крупного рогатого скота, конины, а также казеина, дрожжевой биомассы, соевых бобов и др.
Важнейшим компонентом многих питательных сред являются пептоны – продукты ферментативного гидролиза белков мяса.
Источниками фосфора – важнейшего биогенного элемента – служат, в основном, фосфаты калия и натрия, а из органических соединений – пуриновые и пиримидиновые основания.
Источниками серы для одних микроорганизмов могут быть сульфаты различных металлов (окисленная форма серы), для других – тиосульфаты (восстановленная форма серы). Основным органическим источником серы являются аминокислоты цистеин, метионин.
Все металлы – калий, магний, натрий, железо (макроэлементы) микроорганизмы получают в виде катионов неорганических солей.
Другие минеральные элементы – кобальт, марганец, молибден, медь, цинк (микроэлементы) в среды не добавляют, т.к. они в достаточном для микроорганизмов количестве присутствуют в виде примесей к макроэлементам, а также в воде.
Кислород и водород – наиболее доступные для микроорганизмов элементы. Они входят в состав воды, многих солей, всех органических соединений. Однако многим микроорганизмам и, прежде всего, строгим аэробам, необходим и молекулярный кислород (О2), поступающий из воздуха.
Для роста и размножения некоторых микроорганизмов, кроме источников углерода, энергии и минеральных элементов, требуются вещества, названные факторами роста. К ним относятся аминокислоты, витамины, пуриновые и пиримидиновые основания.
Все живые клетки нуждаются в источниках питания, содержащихся в питательных средах. Питательная среда обеспечивает жизнедеятельность, рост и развитие биообъектов. Прежде чем начинать работы по культивированию разных типов клеток, необходимо точно знать их питательные потребности и зависимости.
Постоянным компонентом питательных сред является вода, в которой нуждаются все живые клетки. Некоторые компоненты питательных сред, находящиеся в твердом агрегатном состоянии, могут либо образовывать придонный осадок, либо равномерно распределяться по всему объему в виде взвеси, либо плавать на поверхности раствора (частицы угля).
В больших количествах клеткам необходимы макроэлементы: углерод, азот, кислород, водород, фосфор, сера, калий, кальций, магний. Снабжение клеток кислородом и водородом осуществляется за счет воды. Углерод является составной частью всех органических соединений и его источники многочисленны и многообразны: чаще всего сахара, многоатомные спирты и органические кислоты. В качестве азотистого субстрата для изготовления питательных сред служат в основном белки животного и растительного происхождения.
Клетки в незначительных количествах нуждаются также и в некоторых микроэлементах: натрий, марганец, никель, кобальт, хлор, цинк, медь, кремний и некоторые другие. Кроме основных компонентов, питательные среды могут содержать факторы роста. Это органические соединения (витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания и др.), в которых нуждаются ауксотрофные клетки и которые они синтезировать не в состоянии. Отсутствие таких веществ приводит к нарушению обменных процессов и прекращению роста клеток. В качестве необходимых компонентов питательных сред могут выступать газы: NH3, H2S, CO2, N2, O2, H2, CH4. Углеводы (обычно это сахароза или глюкоза) входят в состав любой питательной смеси в концентрации 2-3%. Они необходимы в качестве питательного компонента.
Обязательными компонентами питательных сред должны быть фитогормоны. К ним относятся ауксины, вызывающие дифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления.
Питательные среды могут иметь неопределенный состав, т. е. включать биогенные добавки (растительного, животного или микробного происхождения), например мясной экстракт, дрожжевой экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т. д. Такие питательные среды называются натуральными. Применяют также среды, приготовленные из чисто химических соединений в заранее определенных соотношениях. Это так называемые синтетические среды. Применение находят и полусинтетические питательные среды, сочетающие в своем составе компоненты как натуральных, так и синтетических сред. Среды данных типов имеют как преимущества, так и недостатки.
Все питательные среды по составу делятся на натуральные и синтетические.
Натуральные – состоят из продуктов животного или растительного происхождения (овощные или фруктовые соки, ткани животных, молоко, отвары мяса, вытяжки почвы, различные части растений). Преимущества: развиваются многие микроорганизмы, поскольку такие среды содержат все компоненты, необходимые для их роста и развития. Недостатки: имеют сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов, так как в них трудно учесть потребление ряда компонентов и образование продуктов метаболизма.
Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления биомассы и для диагностических целей.
Синтетические – это среды, в которые входят лишь соединения определенного химического состава, взятые в точно указанных количествах. Такие среды готовятся для определенной культуры бактерий, метаболизм которой заранее известен исследователю. Широко используются при исследовании обмена веществ, физиологии и биохимии микроорганизмов. Преимущества: можно приготовить подобную синтетическую среду для развития микроорганизмов. Применяются для анализа жизнедеятельности бактерий. Например, можно узнать, какие вещества они выделяют в окружающую среду и сколько. Недостатки: необходимо знать особенности обмена веществ данного организма и потребности его в источниках питания. Могут иметь относительно большой набор компонентов.
Полусинтетические – среды, главными компонентами которых являются соединения известного химического состава - углеводы, соли аммония, фосфаты и т.д., а натуральные природные компоненты содержатся в небольших количествах (дрожжевой автолизат, почвенный экстракт или гидролизаты молока, казеина и т.п.). Недостатки: непостоянство состава. Преимущества: обладают хорошими ростовыми свойствами, относительно недороги. Они находят широкое применение в промышленной микробиологии для получения аминокислот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.
По назначению
Общего назначения – (преимущество) эти среды пригодны для культивирования большого количества известных микроорганизмов. На таких средах способны развиваться бактерии, актиномицеты, грибы, дрожжи. Недостатки: скорость развития каждого микроорганизма будет зависеть от степени соответствия химического состава такой среды питательным потребностям клетки.
Элективные – предназначены для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания. Преимущества: состав идеально подобран для жизнедеятельности только одного вида микроорганизмов. Например, такая элективная среда пригодна только для размножения кишечной палочки. Тогда из посева множества бактерий на чашке Петри мы увидим только колонии той самой кишечной палочки и никакие больше. Недостатки: необходимо хорошо знать метаболизм исследуемой бактерии, чтобы удачно ее отобрать из смеси других видов.
Дифференциально-диагностические – (преимущество) дают возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других или выявить некоторые их особенности. Примером индикаторной среды для выявления кишечной палочки в естественных субстратах может служить агарированная среда Эндо. Бактерии из рода Escherichia на этой среде образуют розовые и малиновые колонии с металлическим блеском, а бактерии рода Salmonella - бесцветные. Недостаток: при составлении учитываются характерные питательные потребности конкретного микроорганизма.
Широко применяются в санитарной и медицинской микробиологии для быстрой идентификации определенных групп микроорганизмов.
Консервирующие (транспортные) среды используются широко в клинической практике для сохранения жизнеспособности микроорганизмов в период от момента взятия биоматериала до посева. Преимущества: сохранение жизнеспособности микроорганизма, причем не менее 8 - 12 часов при комнатной температуре, предупреждение размножения микроорганизмов. Недостаток: сложный состав, строгие требования.
По консистенции
Жидкие среды (преимущества) широко применяют для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена, а также поддержания и хранения многих микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах. Преимущество: возможность равномерного распределения зародышей. Недостаток: при помещении в такую среду эксплантов часто имеет место их гибель вследствие создания неблагоприятных для развития эксплантов анаэробных условий.
В основном недостатки одинаковые: строгие требования к составу, предварительно нужно знать потребности конкретного биообъекта.
Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, реже – для накопления биомассы (например, анаэробов).
Сыпучие – основу их составляют зерно, жмыхи, разваренное пшено, отруби и другие подобные вещества.
Плотные среды используют для выделения чистых культур микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, для хранения культур, количественного учета микроорганизмов.
Исследование культивирования микроорганизмов начинается с 1830 г., когда Ш. Каньяр де Латур, К. Кютцинг и Т. Шванн открыли причину брожения вина (наличие клеток дрожжей).
В дальнейшем в области культивирования клеток не было никакого прогресса вплоть до 1850-х гг., когда Л. Пастер начал свои фундаментальные исследования: изучение физиологии дрожжей и бактерий, введение асептических методов, минимальных сред и исследование пищевых потребностей микроорганизмов и роли кислорода в процессах их жизнедеятельности. Работами Л. Пастера и его ученика Манона Ролэна была установлена потребность в главных и второстепенных компонентах среды и в источниках энергии. Первая полная среда определенного состава была получена М. Ролэном в 1869 г. для культивирования грибов рода Aspergillus. Ролэн определил пищевые потребности грибов не только качественно, но и количественно.
Говоря о замечательных работах Л. Пастера и М. Ролэна, необходимо отметить, что в их распоряжении не было метода чистых культур, предложенного Р. Кохом несколько позже (в 1870-е гг.) и дающего значительные преимущества выращивания микроорганизмов. Начиная с изящных работ Коха, методы культивирования стали основной заботой микробиологов.
Потребность микроорганизмов в сложных органических веществах − факторах роста − впервые была обнаружена Вильдье в 1901 г., когда он открыл витамин В, или «факторы биос», необходимые для роста дрожжей.
В 1930-е гг. с введением метода колб на качалках началось развитие аппаратуры культивирования. Это дало возможность применять лабораторный метод для аэрации глубинных культур, особенно глубинных культур аэробных грибов, которые раньше выращивались только на поверхности твердых или жидких сред. В поверхностных культурах окружение организма гетерогенно, а в глубинных – гомогенно, что проще для изучения и контроля. Впоследствии глубинные культуры аэробных грибов сыграли значительную роль в развитии промышленного производства антибиотиков. Возрастающее технологическое значение культуры микроорганизмов значительно стимулировало интерес к этой области и привело в 40−50-е гг. к созданию ферментеров с автоматической регуляцией условий среды. С этого времени благодаря активному развитию теории непрерывного культивирования хемостатного типа открылись широкие горизонты не только теоретического развития, но и практического применения культур клеток.
Существуют следующие методы:
– метод серийных разведений в жидких питательных средах (Пастер): из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде. Для этого каплю посевного материала вносят в пробирку со стерильной жидкой средой, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так засевают до 8…10 пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться и можно получить такое разведение, в котором во всей пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма.
– метод пластических разведений на плотных питательных средах (Кох): применяют, если в исследуемом материале содержится много бактерий. Готовят десятикратные разведения материала в пробирках, затем выливают содержимое пробирок в стерильные чашки Петри, заливают 20 мл расплавленного и остуженного до 450С МПА, перемешивают, дают агару застыть и инкубируют чашки в термостате.
– метод рассева материала по поверхности плотных питательных сред (по Дригальскому): при таком посеве материал, находящийся на петле, расходуется постепенно, и по линиям сетки, нанесённым в конце посева, вырастают изолированные колонии бактерий.
2) Физический – для выделения спорообразующих микроорганизмов материал обрабатывают t°=70-80°С, при этом вегетативные формы погибают, остаются только споры.