где ln – натуральный логарифм.
Условия культивирование дрожжей
Дрожжи является хемоорганогетеротрофамы и используют органические соединения как для получения энергии, так и в качестве источника углерода. Им необходим кислород для дыхания, однако при его отсутствии большинство видов могут получать энергию за счет брожения с выделением спиртов (факультативные анаэробы). В отличие от бактерий, среди дрожжей есть облигатные анаэробы, гибнущие при наличии кислорода в среде. При пропускании кислорода через сбраживаемый субстрат дрожжи прекращают брожение и начинают дышать (поскольку этот процесс эффективнее), используя кислород и выделяя углекислоту. Это ускоряет рост дрожжевых клеток (эффект Пастера). Однако даже при доступе кислорода в случае высокого содержания глюкозы в среде дрожжи начинают его сбраживать (эффект Крэбтри).
Дрожжи достаточно требовательны к условиям питания. В анаэробных условиях дрожжи могут использовать в качестве источника энергии только углеводы, причем в основном гексозы и построенные из них олигосахариды. В аэробных условиях круг усваивания субстратов шире: помимо углеводов также жиры, углеводороды, ароматические углеводородные соединения, спирты, органические кислоты. Довольно много видов способны использовать пентозы в аэробных условиях. Тем не менее, сложные соединения (лигнин, целлюлоза) для дрожжей недоступны.
Источником азота могут быть соли аммония, примерно половина видов имеют нитратредуктазы и способны усваивать нитраты.
Условия культивирования грибов
В лабораторных условиях чистые грибные культуры получают при выделении из исследуемого материала методами механического разобщения и культивирования на искусственных питательных средах. Грибы растут медленнее бактерий, видимый рост их колоний на твердых питательных средах обычно наблюдается на 3-5 день. Образование колоний грибов на твердых питательных средах — результат апикального роста главной гифы и ее ответвлений.
Грибы обладают выраженной сахаролитической активностью, поэтому их выращивают на специальных средах, содержащих углеводы:
среда Сабуро,
сусло-агар,
морковный агар и другие, при этом pH среды должно составлять 6,0-6,5.
Для роста грибам необходимы соли фосфора и серы, накопить большую биомассу грибов для промышленных целей позволяют добавки ионов меди, магния и натрия, витаминов: биотина, рибофлавина, тиамина.
Грибы растут в широком диапазоне температур (20-450С), грибы, вызывающие заболевания человека, обычно культивируются при температуре 37˚С. При росте многоклеточных грибов на питательных средах различают субстратный или погружной мицелий (врастающие колонии, большая часть в среде) и воздушный мицелий (большая часть его находится над питательной средой). С воздушным мицелием связано образование конидий, с субстратным — бласто-, хламидо-, и артроспор.
Условия культивирования бактерий
Рост и развитие бактерий возможны лишь при определенных факторах и значениях каждого из них:
1.Температура. Различают три группы бактерий, отличающихся температурными предпочтениями:
термофилы, или теплолюбивые микробы, растут при 45-90°С, а значит, не размножаются в организмах человека и животного;
психрофилы, или холодолюбивые микроорганизмы, предпочитают температуру в интервале 5-15 °С и выращиваются в холодильных камерах;
мезофилы, развиваются при температуре 25-37 °С, к ним относится основная масса бактерий.
2.Свет. Является особенностью культивирования бактерий-фототрофов, поскольку они осуществляют фотосинтетический процесс. Но для большинства микробов освещение не является обязательным условием. И даже наоборот, солнечный ультрафиолет может подавлять их развитие.
3. Вода. Всем микроорганизмам необходима вода в доступной (жидкой) форме. Вот почему в замороженных продуктах бактерии практически не развиваются.
4. Аэрация. Кислород, как химический элемент, является составной частью воды и немалого количества соединений, применяемых для выращивания микроорганизмов. Газообразный кислород также может содержаться в воде и прочих жидкостях в растворенном виде. Существенная часть бактерий нуждается в постоянном поступлении молекул кислорода. Но ряду микроорганизмов он без надобности, или, хуже того, газообразный кислород токсичен для них, поскольку они не имеют каталазы и пероксидазы, разрушающих токсичные продуты дыхания. Поэтому важнейшим этапом культивирования анаэробных бактерий является удаление молекул О2 из питательной среды.
5. Культивирование микроорганизмов. Выращивание аэробных и анаэробных бактерий проводится в различных слоях среды и в разных режимах.
Способ культивирования зависит от конечной цели культивирования (целью является либо накопление биомассы, либо получение определенного продукта жизнедеятельности – метаболита).
Ферментация (культивирование) – это вся совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную питательную среду посевного материала (инокулята) до завершения процессов роста и биосинтеза вследствие исчерпывания питательных веществ среды.
По наличию или отсутствию перемешивания бывает динамическое и статическое культивирование.
Периодическое культивирование микроорганизмов может быть представлено статическими, динамическими и продленными способами культивирования. Статические процессы осуществляются в стационарных условиях без перемешивания. При этом аэробные микроорганизмы обычно развиваются на поверхности жидкой или твердой среды (поверхностное культивирование), например, поверхностный способ жидкофазного культивирования Aspergillus niger для получения лимонной кислоты.
Периодические динамические процессы осуществляются с помощью перемешивания и аэрации: в жидких средах на качалках, в биореакторах при помощи мешалки и барботера.
Ранее более широкое применение находило культивирование микроорганизмов на поверхности плотных питательных сред. Применение жидких питательных сред позволило избежать некоторых недостатков, связанных с культивированием поверхностным способом, требуя постоянного перемешивания культуры с целью выравнивания условий роста организма в различных частях рабочего объема сосуда. Эту систему можно уже назвать динамической в отличие от описанной выше статической при стационарном культивировании.
Ранее более широкое применение находило культивирование микроорганизмов на поверхности плотных питательных сред. Применение жидких питательных сред позволило избежать некоторых недостатков, связанных с культивированием поверхностным способом, требуя постоянного перемешивания культуры с целью выравнивания условий роста организма в различных частях рабочего объема сосуда. Эту систему можно уже назвать динамической в отличие от описанной выше статической при стационарном культивировании.
Периодический метод культивирования предусматривает внесение посевного материала в питательную среду (инокуляция клетками среды) в начале процесса и получение культуры по достижении заданной фазы развития популяции. Концентрация микроорганизмов в периодической культуре нарастает и останавливается либо из-за лимитирования субстратом, либо из-за ингибирования токсичными продуктами жизнедеятельности. Для этого типа культивирования характерно непрерывное изменение физиологического состояния клеток, вызванное изменениями условий, производимыми жизнедеятельностью самих клеток. Отсюда следует, что периодическая система может поддерживать размножение клеток только в течение ограниченного времени. После фазы экспоненциального (логарифмического) роста популяция начинает испытывать недостаток элементов питания и угнетается продуктами метаболизма, что ведет к нарушению физиологического состояния клеток. Периодические культуры находятся в неустойчивом состоянии, что является серьезным недостатком, особенно когда их применяют при изучении свойств микроорганизмов.
Практически все системы периодического культивирования являются закрытыми, поскольку микроорганизмы в них размножаются и проходят все фазы развития без притока питательной среды и оттока культуральной жидкости.
В простой гомогенной периодической культуре можно выделить несколько фаз роста(лаг-фаза, фаза экспоненциального роста, стационарная фаза, фаза отмирания.)
Культивирование микроорганизмов может осуществляться в открытой или закрытой системе.
Система называется закрытой, если ни одна составная часть этой системы после начала процесса в биореакторе не вводится и не выводится. В периодическом процессе в ферментер сначала подают все питательные вещества, водную фазу и посевной материал. Процесс идет в соответствии с кривой роста микроорганизмов с заключительным замиранием реакции, обусловленным недостатком субстрата, накоплением токсических метаболитов, неблагоприятным изменением физико-химических условий окружающей среды (рН, температура, парциальное давление кислорода, вязкость), гибелью и лизисом микроорганизмов. Во время культивирования все параметры непрерывно изменяются. Развитие управляемых периодических процессов привело к созданию объемно-доливочной системы: в процессе культивирования главные компоненты среды добавляют дробно, чем исключают субстратное ингибирование (торможение ферментативной реакции, вызванное избытком субстрата). Никакие жидкие компоненты из среды не отводят.
Открытые системы работают в непрерывном потоке. В процессе реакции часть отработанной питательной среды из биореактора удаляют и добавляют новую, что обеспечивает непрерывность процесса. В единицу времени субстрата вводят не больше, чем может переработать культура. Проводят непрерывное культивирование по крайней мере с одной лимитирующей рост концентрацией вещества. Регулирование осуществляют поддержанием концентрации биомассы или продукта на постоянном уровне путем изменения концентрации субстрата (турбидостат) или применения строго лимитированной концентрации питательных веществ с соответствующим изменением концентрации клеток или продукта (хемостат).
Культивирование микроорганизмов можно поводить поверхностным или глубинным, периодическим или непрерывным методами, в аэробных или анаэробных условиях. Большое значение при выборе способа культивирования имеет отношение выбранного культивируемого микроорганизма к молекулярному кислороду и конечная цель культивировании, которой может быть либо накопление биомассы клеток, либо получение определенного метаболита (спирта, кислорода, фермента и т.д.).
Поверхностное культивирование. При поверхностном культивировании микроорганизмы развиваются на поверхности питательной среды. Среды могут быть плотными, сыпучими или представлять собой тонкий слой жидкой среды. Практически метод применим только для культивирования аэробных микроорганизмов. В этом случае микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. Важным условием реализации метода является большая площадь соприкосновения поверхности питательной среды с окружающим воздухом. В жидких средах аэробные микроорганизмы часто растут, образуя на поверхности пленку. Факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение. Этим методом ранее в промышленных масштабах получали лимонную кислоту и некоторые ферментные препараты для собственных нужд на заводах малой мощности. В настоящее время в промышленности его почти не применяют и подобная технология считается устаревшей. Поверхностное культивирование микроорганизмов используют в основном, в лабораторной практике в научных исследованиях и в музеях чистых культур.
Глубинное культивирование. Глубинный метод культивирования является более совершенным по сравнению с поверхностным. При этом микроорганизмы растут и развиваются во всем объеме питательной среды, а не только на ее поверхности. Осуществляют его, применяя жидкие питательные среды. Метод можно использовать как при культивировании аэробов, так и анаэробов. Совокупность остатков питательной среды, растущих в ней микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности, образующихся при глубинном культивировании, называется культуральной жидкостью. При культивировании аэробных микроорганизмов необходимо обеспечить большую поверхность соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха, так как при глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому для обеспечения роста аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать - подводить кислород во всю толщу жидкой среды. В результате питательная среда насыщается кислородом воздуха и создаются благоприятные условия для развития аэробов.