Рис. 12. Цитохалазин-индуцированные изменения активности лектинов клеточной стенки в обработанных АБК корнях трех сортов озимой пшеницы: 1 - Безостая 1; 2 - Мироновская 808; 3 - Альбидум 14.
В связи с этим можно предположить, что увеличение активности лектинов клеточной стенки через сутки после добавления АБК или картолина, действие которого также, возможно, опосредовано его влиянием на уровень АБК, вызвано разборкой микрофиламентов.
Совместная обработка АБК и низкими температурами в корнях закаленных растений уменьшала эффект цитохалазина на активность лектинов у Безостой 1 и Мироновской 808, но повышала у Альбидум 114 по сравнению с вариантом без АБК. Одной из причин различной сортовой реакции активности лектинов на модификацию актинового цитоскелета в условиях низкотемпературного закаливания и обработки АБК может быть неодинаковая степень взаимодействия актиновых и тубулиновых структур. Показано, что взаимосвязь микрофиламентов с плазматической мембраной зависит от структурной целостности и организации кортикальных микротрубочек (Tominaga et al., 1997). Хохловой и Олиневич (2003) обнаружено, что низкие температуры значительно уменьшали стабилизирующий эффект АБК на микротрубочки в клетках Альбидум 114. Возможно, снижение стабильности тубулинового цитоскелета высокоморозоустойчивого сорта в этих условиях способствует деполимеризации актиновых филаментов и, как следствие, высвобождению лектинов клеточной стенки.
Са2+-зависимые изменения активности лектинов при действии оризалина
В литературе констатируется разнообразное влияние Са2+ на цитоскелет. Процессы сборки и разборки микротрубочек и микрофиламентов, связывание их в пучки, взаимодействие с органеллами и мембранами, сохранение целостности цитоскелетных структур и их функций определяется концентрацией Са2+ в цитозоле (Williamson, 1987). Высказывается мнение о том, что экзогенный Са2+ в зависимости от дозы по-разному модифицирует структурное и полимерное состояние цитоскелетных филаментов (Хохлова и др., 1997), причем эти изменения опосредуются через фосфорилирование связанных с МТ белков, которые стабилизируют или дестабилизируют цитоскелетные структуры (Schliva et al., 1981; Снигиревская, 1990; Cyr, 1991).
В следующей серии экспериментов мы попытались выяснить, как будет изменяться влияние оризалина на активность лектинов при выращивании растений на растворах с разной концентрацией кальция. На фоне разных концентраций Са2+ эффект оризалина был неодинаковым (рис. 13). Низкая концентрация Са2+ (25мкМ) снимала эффект оризалина на активность лектинов клеточной стенки и в незакаленных и в закаленных растениях. Высокая доза Са2+ (1мМ) значительно усиливала чувствительность лектинов клеточной стенки к оризалину, особенно при гипотермии.
Рис.13. Оризалин-индуцированные изменения активности лектинов клеточной стенки в корнях озимой пшеницы при разных концентрациях экзогенного Са2+ в среде: А - без Са2+, Б - (25 мкМ ), В - (1 мМ).
Наши результаты о неоднозначном влиянии Са2+ на стабильность микротрубочек согласуются с данными литературы, свидетельствующими о том, что низкие концентрации кальция стабилизируют микротрубочки, а высокие - дестабилизируют (Schliva et al., 1981). Очевидно, разное содержание Са2+ в среде выращивания, может обусловливать разный уровень фосфорилирования и активности взаимодействующих с микротрубочками белков, способствуя образованию или разрушению микротрубочек и, соответственно, снижению или повышению активности лектинов.
Блокатор кальциевых каналов верапамил также, как и оризалин, уменьшал активность растворимых лектинов и увеличивал активность лектинов клеточной стенки у незакаленных растений (рис. 14).
Учитывая установленную корреляцию между стабильностью цитоскелета и активностью лектинов, можно предположить, что нарушение процессов фосфорилирования ассоциированных с МТ белков приводит также к дезорганизации МТ. Очевидно, этим может объясняться отсутствие влияния оризалина в растениях, выращенных на среде с верапамилом (рис. 14). В закаленных растениях наблюдали усиление эффекта оризалина на активность лектинов (рис. 14). По-видимому, в растениях с поврежденной передачей кальциевого сигнала тормозится образование холодостойких МТ, в результате чего увеличивается восприимчивость лектинов клеточной стенки к оризалину. Таким образом, можно полагать, что работа Са2+-сигнальной системы необходима для стабилизации МТ.
Влияние оризалина на митотический индекс и относительную длительность фаз митоза. Чтобы иметь доказательства перестройки цитоскелета при действии оризалина в следующей серии экспериментов мы изучали зависимость митотической активности корневых меристем и длительности фаз митоза от структурного состояния цитоскелета у трёх сортов озимой пшеницы. Известно, что оризалин подавляет клеточное деление, растяжение и дифференцировку клеток (Giani et al., 1998). Во время митоза микротрубочки формируют препрофазное кольцо (поясок), митотическое веретено и фрагмопласт (Nick, 1999; Sano et al., 2007; Lee, Liu, 2007; Schmit, Nick, 2008).
Инкубация в растворе оризалина в течение 3-х часов вызывала типичный к-митоз в клетках исследуемых растений. К-митоз или колхициновый митоз является одной из патологических форм митоза, которая характеризуется блокадой деления клетки в метафазе в связи с повреждением митотического аппарата. В наших экспериментах наблюдались метафазы с хромосомами, рассеянными по всей цитоплазме, патологии анафазы и телофазы в виде хромосомных и хроматидных мостов и образование микроядер.
Инкубация корней проростков в оризалине в течение 3-х часов приводила к увеличению митотического индекса (МИ) (табл. 3), что связано, по-видимому, с блокадой клеточного цикла на различных фазах митоза. При этом наблюдали накопление анафаз, исчезновение телофаз, относительное содержание профаз и метафаз под влиянием ингибитора изменялось незначительно.
Таблица 3. Митотический индекс корневых меристем трёх сортов озимой пшеницы (%)
|
Варианты |
Безостая 1 |
Мироновская 808 |
Альбидум 114 |
|
|
Незакалённые |
||||
|
Контроль |
3,820,20 |
4,580,17 |
3,940,20 |
|
|
Оризалин (10 мкМ) |
7,301,90 |
7,130,21 |
9,840,56 |
|
|
Закалённые (2-30, 7 суток) |
||||
|
Контроль |
3,320,11 |
3,58-0,15 |
2,960,08 |
|
|
Оризалин (10 мкМ) |
7,760,13 |
5,260,36 |
4,910,08 |
В закалённых растениях инкубация в оризалине также повышала МИ у всех исследуемых сортов, но у Мироновской 808 и Альбидум 114 в меньшей степени, чем в незакаленных растениях (табл. 3). У морозоустойчивых сортов закаливание приводило к появлению небольшого числа телофаз при действии оризалина: у Мироновской 808 - 1% телофаз, у Альбидум 114 - 4% (рис. 15).
Возникновение телофаз обусловлено, вероятно, преодолением частью клеток прометафазно-анафазного блока. Данный факт можно рассматривать как повышение стабильности микротрубочек митотического веретена, что может способствовать восстановлению клеточного цикла и ростовых процессов после гипотермии.
Рис. 15. Длительность фаз митоза в корневых меристемах обработанных оризалином незакаленных и закаленных растений трех сортов озимой пшеницы: А - контроль, Б - оризалин (10 мкМ), 1 - профаза, 2 - метафаза, 3 - анафаза, 4 - телофаза.
Эти данные согласуются с вышеописанными результатами, свидетельствующими о большей, по сравнению с другими сортами, стабилизации тубулиновых структур в процессе низкотемпературного закаливания у Альбидум 114. С помощью иммунофлуоресцентной микроскопии также было показано, что стабильность микротрубочек повышалась после холодовой адаптации у морозоустойчивых сортов (Olinevich et al., 2002).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, исходя из наших данных и данных литературы, можно представить, что в ответ на внешний сигнал (температура, атака патогена, фитогормоны) уже через несколько секунд происходит так называемый «кальциевый всплеск», который индуцирует, с одной стороны, формирование первичных неспецифических ответов клетки, к которым относится и активация лектинов клеточной стенки, а с другой - разборку МТ.
В свою очередь, высвобождение и/или модификация лектинов клеточных стенок, в т.ч. и арабиногалактановых белков (первый пик активности, связанный, вероятно, с высвобождением АГБ из плазматической мембраны за счет активации фосфополипаз С и Д), под влиянием низких температур, фитогоромонов или микоплазменной инфекции приводит к изменению трансмембранных взаимодействий в системе клеточная стенка - плазмалемма - цитоскелет. В результате повышается динамическая нестабильность микротрубочек и микрофиламентов. Показано, что реагент Ярива или антитела на АГБ стимулируют разборку микротрубочек и их удаление от мембраны (Nguema-Ona et al., 2007).
Начальная частичная разборка тубулиновой сети, наблюдаемая через 12 часов гипотермии, необходима для развития адаптации и повышения терморезистентности растений (Abdrachmanova et al., 2003; Nick, 2008). Такая деструкция является кратковременной и через сутки действия низких температур наблюдается восстановление уже более стабильных микротрубочек.
При атаке патогена также наблюдается быстрая, в течение суток, разборка тубулинового (Biner et al., 2001; Yuan et al., 2006) и актинового (Thomas, Franklin-Tong, 2004; Tsurushima et al., 2005; Yuan et al., 2006) цитоскелета.
Предполагается, что МТ контролируют состояние Са2+-каналов. В частности, разборка МТ приводит к их открыванию (Nick, 2008), в результате повышается концентрация Са2+ в цитозоле и активируются Са2+ - зависимые сигнальные каскады, функционирование которых приводит к экспрессии генов, ответственных за формирование устойчивости растения.
Рис. 16. Схема регуляции активности лектинов клеточной стенки с участием цитоскелета и Са2+-сигнальной системы: МТ - микотрубочки, МФ - микрофила-менты, ФЛС - фосфолипаза С, ДАГ- диацилглицерол, ИФ3-инозитол-3-фосфат, ПК- протеинкиназа, ФРТ-факторы регуляции транскрипции, ЭПР-эндоплазматический ретикулум.
В то же время дезорганизация элементов цитоскелета также приводит к высвобождению лектинов в клеточной стенке и повышению их активности (второй пик активности лектинов, наблюдаемый через 6 ч и более). Происходящая при этом активация сигнальных систем запускает каскад реакций, обеспечивающих скоординированное функционирование защитно-приспособительных систем в клетках и формирование устойчивости растений. В конечном итоге стабилизируются цитоскелетные структуры и усиливается их взаимодействия с плазмалеммой. В результате снижается активность лектинов клеточной стенки, и клетка переходит на другой уровень метаболизма (рис. 16).
ВЫВОДЫ
1. Высокая активность лектинов клеточной стенки, характерная для устойчивых к морозу сортов пшеницы, позволяет использовать это свойство для экспресс-диагностики морозоустойчивости сортов.
2. Неспецифическая устойчивость растений пшеницы к действию как и биотических (инфицирование микоплазмами), так и абиотических (низкие температуры) факторов внешней среды реализуется, в том числе, и путем изменений активности лектинов клеточной стенки. Начальным этапом формирования неспецифического защитного ответа растений является быстрое изменение активности и состава лектинов клеточной стенки, которое зависит от функционирования кальциевой сигнальной системы и может быть связано с участием лектинов в проведении сигнала в клетку или в апопластном пространстве.
3. Наличие арабиногалактановых белков во фракции лектинов клеточной стенки свидетельствует об участии лектинов в образовании контактов между клеточной стенкой и цитоскелетом.
4. Органо- и сортоспецифичные изменения активности растворимых и связанных с клеточной стенкой лектинов при действии цитоскелет-деполимеризующих препаратов указывают на зависимость активности лектинов от структурной целостности цитоскелета.
5. Установлено участие соединений гормональной природы в регуляции взаимодействия между цитоскелетом и лектинами клеточной стенки.
6. Абсцизовая кислота и картолин контролируют активность как растворимых, так и связанных с клеточной стенкой лектинов. Предобработка этими регуляторами роста для дополнительного к действию низких температур повышения устойчивости растений к холоду является эффективной лишь для слабоморозоустойчивых сортов пшеницы.
7. Салициловая кислота увеличивает активность растворимых лектинов в большей степени, чем лектинов клеточной стенки. Экзогенная салициловая кислота практически снимает изменения активности лектинов, индуцированные инфицированием микоплазмами и одновременно повышает морозоустойчивость растений.
8. Совокупность полученных данных свидетельствует о важной роли лектинов клеточной стенки в рецепции и трансдукции внешнего сигнала внутрь клетки, что обеспечивает выживаемость растений в неблагоприятных условиях среды.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК для публикации докторских диссертаций
1. Хохлова Л.П., Тимофеева О.А., Заботин А.И. и др. Изменения мембран и энергетических функций митохондрий при закаливании и действии картолина// Физиология растений. 1990. Т.37, №.2. С. 308-316.
2. Тимофеева О.А., Хохлова Л.П,, Таненкова Е.А., Токина Е.И. Активность лектинов в связи с функционированием вторичных посредников при адаптации растений к низким температурам// Доклады РАН. 1996. Т.350, №5. С. 716-718.