Автореферат: Лектины как активные компоненты адаптивных реакций озимой пшеницы к неблагоприятным условиям среды

Растворимые лектины экстрагировали 5 мл 0.05 М HCl (Шакирова и др., 1983), лектины клеточных стенок - 0.05% раствором тритона Х-100 и 0.9% раствором NaCl (Комарова, 1995) из фракции клеточных стенок (Feiz et al., 2006). Дальнейшая очистка лектинов клеточной стенки включала высаливание сульфатом аммония (30% насыщения) и дифференциальное денатурирование ацетоном.

Для анализа состава лектинов клеточной стенки использовали хроматографическую систему с колонкой (55см х 0.8см, Sephadex G150). Элюцию проводили буферной смесью (0.9% NaCl, 50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7.4) со скоростью 0.5 мл/мин. Адсорбированные на колонке лектины элюировали 0.1 М раствором D-глюкозы в буферной смеси. Объем отбираемых фракций составлял 0.5 мл.

Активность лектинов определяли по минимальной концентрации белка, вызывающей агглютинацию трипсинизированных эритроцитов I группы крови (Луцик и др., 1981). Эритроциты этой группы крови были подобраны в предварительных экспериментах как наиболее чувствительные по отношению к исследуемым лектинам. Содержание белка в выделенных экстрактах определяли по методу (Bradford, 1976). Арабиногалактановые белки идентифицировали по реакции с реагентом Ярива (Yariv, 1962).

Митотическую активность клеток корневых меристем анализировали микроскопически методом давленых препаратов по величине митотического индекса (отношение делящихся клеток к общему числу клеток, выраженное в процентах).

Об изменении морозоустойчивости судили по выходу электролитов, определяя LT50 согласно (Uemura, Steponkus, 1989).

Одномерный электрофорез проводили в 12% полиакриламидном геле в присутствии 2% додецилсульфата натрия по Леммли (Laemmli, 1970). Молекулярную массу полипептидов определяли по методу Вебера и Озборна (Weber, Ozborn, 1969).

Исследования с ингибиторами цитоскелета включали две схемы опытов. В первой серии опытов незакаленные растения трех сортов озимой пшеницы без АБК и картолина выращивали при 23о С 9 суток. К половине 6-суточных проростков добавляли раствор АБК (30 мкМ) или картолина (33 мкМ), затем они росли с регуляторами роста в течение 3-х суток (возраст незакаленных проростков с АБК или картолином - 9 суток). Закаливание 7-суточных растений проводили в термокамере при 3о С в течение 7 суток. Общий возраст закаленных растений, выращенных как с АБК и картолином, так и без них составлял 14 дней. Оризалин и цитохалазин Б вводили в ткани корней и листьев вышеописанными методами.

В экспериментах по исследованию митоза незакаленные растения имели возраст 5 суток. Закаливание 4-х суточных проростков проводили в течение 7 суток (общий возраст закаленных растений -11 суток). Регуляторы роста АБК (30 мкМ) и картолин (33 мкМ) вносили в среду выращивания за сутки до закаливания (общий возраст растений, выращенных на среде с добавлением АБК и картолина, составил 5 суток). Корни инкубировали в растворе оризалина (10 мкМ) 3 ч.

Эксперименты проводили не менее, чем в 3-кратной биологической повторности. В таблицах и рисунках представлены средние арифметические и стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Активность лектинов при действии на растения низких температур

Изменения лектиновой активности в проростках озимой пшеницы, контрастных по холодоустойчивости сортов

Сравнение лектиновой активности в различающихся по морозоустойчивости сортах показало, что наибольшая активность растворимых лектинов наблюдалась у маломорозоустойчивого сорта Безостая 1, а наименьшая - у высокоморозоустойчивого Альбидум 114. Активность лектинов клеточной стенки, наоборот, была наименьшей у Безостой 1, а наибольшей у Альбидум 114 (рис. 1). У всех исследуемых сортов активность лектинов как растворимых, так и связанных с клеточной стенкой, в корнях была выше, чем в листьях. Эти результаты согласуются с данными литературы. Так, в работе Райхель (Raikhel et al., 1984) было показано, что больше всего лектинов содержится в семенах, а затем по степени убывания - в семядолях, корнях, стеблях, листьях.

Рис. 1. Активность растворимых лектинов (А) и лектинов клеточной стенки (Б) в листьях и корнях проростков озимой пшеницы Безостая 1(1), Мироновская 808 (2), Альбидум 114 (3).

Динамика активности лектинов клеточной стенки при низкотемпературном закаливании была фазной (рис. 2). Такая фазность кривой, отражающая изменения активности лектинов клеточной стенки в ответ на стрессоры различной природы, свидетельствует об их участии в формировании стрессового состояния или неспецифического адаптационного синдрома клеточной системы. После стресса, который обуславливает реализацию резерва адаптации, организм переходит на более высокий уровень потенциальных возможностей, повышается морозостойкость организма и его частей (Тимофеева и др., 1999; Гараева и др., 2006).

При сравнении кривых, отражающих изменения активности лектинов клеточной стенки в процессе низкотемпературного закаливания, обращает на себя внимание тот факт, что у наиболее устойчивых сортов Альбидум 114 и Мироновская 808 все этапы неспецифического адаптационного синдрома проходят быстрее, чем у менее морозоустойчивого сорта Безостая 1.

Очевидно, более высокий уровень активности лектинов у морозоустойчивого сорта обеспечивает им интенсивную скорость прохождения адаптационных процессов и развитие большей устойчивости.

Рис. 2. Динамика активности растворимых лектинов (А) и лектинов клеточной стенки (Б) корней проростков озимой пшеницы Безостая 1, Мироновская 808 и Альбидум 114 при низкотемпературном закаливании

Активность растворимых лектинов у морозоустойчивых сортов Альбидум 114 и Мироновская 808 постепенно увеличивалась, достигая максимума на 5-е сутки низкотемпературного закаливания, затем она снижалась, оставаясь, тем не менее, выше уровня незакаленных растений. У Безостой 1, напротив, наблюдали уменьшение активности растворимых лектинов. К концу периода закаливания значения лектиновой активности данной фракции сорта Безостая 1 характеризовались почти 40% снижением (рис. 2). В результате проведенных исследований установлено, что лектины клеточной стенки быстрее реагируют на холодовое воздействие по сравнению с пулом растворимых лектинов.

По данным литературы отличительной особенностью классических лектинов пшеницы является то, что в семенах, проростках, и взрослых растениях содержится один и тот же лектин, названный агглютинином зародыша пшеницы (АЗП). Таким образом, тестируя активность растворимых лектинов у разных сортов пшеницы, мы определяем активность одного и того же белка.

Относительно состава лектинов клеточной стенки ничего не было известно на момент начала наших исследований, не было даже до конца установлено, существуют ли в клеточной стенке лектины, отличные от АЗП.

Состав лектинов клеточной стенки и его изменения при действии низких температур

С помощью гель-фильтрации мы провели хроматографическое разделение белков клеточной стенки корней проростков озимой пшеницы Мироновская-808 с последующим тестированием полученных фракций на лектиновую активность (Гараева и др., 2006).

Среди полученных белковых фракций лектиновая активность обнаруживалась во фракциях, содержащих белки с молекулярной массой 85,77, 54, 43 и 17 кД (рис.3А).

Поскольку сефадекс - тип матрицы на основе декстрана, который состоит из крахмала, то вполне возможно, что часть лектинов, специфичных к глюкозе, могла адсорбироваться на сефадексе. Эти лектины элюировали 0,1М раствором D-глюкозы. Большая часть полученных фракций не агглютинировала эритроциты. По-видимому, это моновалентные лектины с одним лишь центром связывания углеводов, специфичным к глюкозе. Тем не менее, некоторые фракции обладали способностью агглютинировать эритроциты.

Среди моновалентных в-лектинов могут быть арабиногалактановые белки (АГБ) (Nothnagel, 1997). Предполагается, что АГБ осуществляют взаимодействие компонентов клеточного матрикса с плазматической мембраной (Kohorn, 2000; Majewska-Sawka, Nothnagel, 2000), поскольку это лектины, лиганды для которых могут находиться в клеточной стенке.

Рис.3. Профили элюирования белков клеточной стенки при действии низких температур. А - контроль; Б - 0,5 ч гипотермии; В - 1 ч гипотермии; Г - 3 ч гипотермии; Д - 6 ч гипотермии; Е - 24 ч гипотермии.

Среди лектинов, выделенных с помощью афинной хроматографии, те, которые агглютинировали эритроциты, не давали окраску с реагентом Ярива, а оставшаяся часть - преципитировали реагент Ярива и, следовательно, их можно отнести к АГБ. Лектин 17 кД также давал окраску с реагентом Ярива, т.е. был АГБ.

Таким образом, среди проанализированных белков клеточной стенки можно выделить по крайней мере 4 группы лектинов:

1) лектины, агглютинирующие эритроциты, неспецифичные к глюкозе и не являющиеся арабиногалактановыми белками;

2) лектины, агглютинирующие эритроциты, неспецифичные к глюкозе и являющиеся арабиногалактановыми белками;

3) лектины, агглютинирующие эритроциты, специфичные к глюкозе и не являющиеся арабиногалактановыми белками;

4) так называемые классические в-лектины, которые не агглютинируют эритроциты, связываются только с глюкозой и являются арабиногалактановыми белками.

Через 30 мин гипотермии происходят значительные изменения состава лектинов (рис. 3Б). Так, исчезают лектины с молекулярной массой 85 и 77 кД и появляются новые, 110, 105, 70, 50, 34 кД. В этих условиях наблюдали повышение содержания белка (табл. 1) и количества пиков (10 против 7 в контроле) во фракции, элюированной глюкозой. В этой фракции преимущественно выявлялись АГБ. Вновь появившийся лектин 70 кД также давал окраску с реагентом Ярива, т.е. по-видимому, был АГБ. Что касается АГБ 14,5 кД, мы склонны считать, что это белок 17 кД, поскольку известно, что модификации АГБ может происходить на посттрансляционном уровне за счет изменения в гликозилировании этих белков, например, при добавлении или потере отдельных углеводных остатков.

Таблица 1. Изменения содержания белков клеточной стенки в корнях проростков озимой пшеницы при действии гипотермии и дилтиазема (мкг/г сырого веса)

Через 1 час низкотемпературного воздействия (рис. 3В) происходило полное обновление состава лектинов. Исчезли все присутствующие ранее лектины и были обнаружены новые с мол. м. 98, 60 и 25 кД. После 3 часов воздействия вновь появились лектины с мол. м. 85, 43 и 34 кД и одновременно увеличилось количество низкомолекулярных белков с лектиновой активностью (рис. 3Г). Это может быть связано либо с распадом высоко- и среднемолекулярных белков, либо с изменением их синтеза. Через 6 ч гипотермии наблюдалось повышение активности лектинов (рис. 2), в белковом спектре появляется лектин 70 кД, обнаруженный после 0,5 ч воздействия низкой температуры и который является АГБ, и лектин 98 кД, присутствующий после 1 ч гипотермии (рис.3Д). При этом увеличивается содержание белка во фракции, элюированной глюкозой (табл. 1).

Через сутки закаливания активность лектинов увеличивается еще больше, содержание белка в этой фракции также повышается (табл. 1), исчезает лектин 70 кД, появляются лектины 17, 5 кД и 60 кД (рис. 3Е).

Особый интерес может представлять лектин 70 кД, появление которого отмечено после 0,5 ч и 6 ч гипотермии, в начальные периоды повышения активности лектинов. Поскольку он относится к АГБ, которые могут быть как адгезивными, так и сигнальными молекулами, возможно, его появление можно отнести к пусковым механизмам формирования защитных реакций клеток.

Активность лектинов при действии на растения микоплазменной инфекции в условиях оптимальных температур и гипотермии

Работы разных исследователей подтверждают участие лектинов в механизмах фитоиммунитета (Любимова, Салькова, 1988; Skripal' et al., 1994; Ладыгина, Бабоша, 1996; Хайруллин, 1994; Антонюк, Игнатов, 2001). Межклеточное узнавание, очевидно, является первым этапом взаимоотношения растения-хозяина и микроорганизма, и роль рецепторов в распознавании чужеродных инфекционных структур могут выполнять лектины, связанные с клеточной стенкой, так называемые в-лектины. Существует немало данных о вовлечении в формирование защитных реакций растений и так называемых классических лектинов, локализованных в цитоплазме и вакуоле. Такие лектины способны связываться со спорами патогенных грибов и другими инфекционными структурами патогенов и вследствие этого подавлять их рост и развитие. Поскольку лектин пшеницы проявляет высокую специфичность к N-ацетилглюкозамину и олигомерам хитина, было высказано предположение о его защитной роли при заражении растений хитинсодержащими фитопатогенами (Mirelman et al., 1975; Шакирова, Безрукова, 2007).