Активность и состав лектинов клеточной стенки при действии ингибиторов кальциевой сигнальной системы. Адекватная реакция растительных тканей на действие различных стрессорных факторов во многом определяется состоянием пусковых сигнальных систем клеток, обеспечивающих скоординированное функционирование в клетках защитно-приспособительных систем. Важными составляющими этих систем могут быть лектины клеточных стенок.
Известно, что некоторые АГБ содержат карбоксилтерминальные гликозил фосфатидилинозитольные «якори», при помощи которых они закрепляются на плазматической мембране. Воздействие низких температур вызывает активацию фосфолипаз С и Д, которые отсекают фосфотидилинозитольный домен АГБ, высвобождая АГБ из плазматической мембраны в клеточную стенку и изменяя их конформацию. Следствием этого может быть появление первого пика активности лектинов клеточной стенки, наблюдаемого через 30 минут гипотермии. Блокирование активности фосфолипазы С неомицином (рис. 8Б) приводит к уменьшению этого пика, а второй пик смещается на более позднее время.
Рис. 8. Активность растворимых лектинов (А) и лектинов клеточной стенки (Б) при действии низких температур и ингибиторов кальциевой сигнальной системы
Ингибиторы потенциал-зависимых Ca2+-каналов верапамил и дилтиазем, также как и неомицин, уменьшали первый пик активности лектинов клеточной стенки (рис. 8Б) и задерживали его появление. Увеличение активности наблюдали лишь через 1 и 3 часа гипотермии соответственно, после чего активность постепенно уменьшалась и в течение первых суток достигла уровня незакаленных растений.
Резкое снижение активности растворимых лектинов под действием исследуемых ингибиторов (рис. 8А) указывает на решающую роль кальциевой сигнальной системы в регуляции их активности.
На фоне дилтиазема после 30 мин действия низких температур (рис. 9А) спектр лектиновых белков не изменился по сравнению с незакаленными растениями (рис. 3). После 1 ч гипотермии (рис. 9Б) с дилтиаземом появились белки с мол. м. 105, 70 и 34 кД, которые в контроле (вариант без дилтиазема) были выявлены через 0,5 ч низкотемпературного воздействия. Через 3 ч гипотермии повышалась активность лектинов в варианте с дилтиаземом (рис. 8Б), увеличивалось количество пиков лектинов (рис. 9В) и содержание белка, элюированного глюкозой (табл. 1). Состав лектинов (рис. 9) незначительно отличался от белков с лектиновой активностью контрольных растений (рис. 3). Исключение составили низкомолекулярные лектины 25 и 11 кД, которые появились через 1 ч и остались после 3 ч действия низких температур.
Рис. 9. Влияние дилтиазема на профиль элюции белков клеточной стенки при действии низких температур в течение 0.5 ч (А), 1 ч (Б), 3 ч (В).
Можно предполагать, что блокирование дилтиазем-чувствительных кальциевых каналов замедляет ответную реакцию организма на стрессовое воздействие и не позволяет клетке быстро реагировать на неблагоприятные условия. Следует также отметить, что спектр индуцированных холодом белков под влиянием дилтиазема (рис. 9) отличался от белков контроля (рис. 3). Так, в варианте с дилтиаземом не были обнаружены белки 110, 98 и 60 кД (рис. 9). Логично предположить их важную роль в формировании морозоустойчивости, поскольку закаливание растений в присутствии дилтиазема не приводило к повышению устойчивости.
В последнее время широко обсуждается возможная роль лектинов клеточной стенки, в частности АГБ, киназ, ассоциированных с клеточной стенкой, и рецепторных протеинкиназ, связанных с лектинами, в осуществлении контакта между клеточной стенкой и плазмалеммой и их участие в проведении сигнала через клеточную поверхность (Sardar et al., 2006; Sardar, Showalter, 2007; Gouget et al., 2006; Baluska et al., 2003). С другой стороны, высказывается предположение о существовании сигнальных путей в апопласте растений (Chivasa et al., 2002). На это указывают данные о существовании протеинкиназ в клеточной стенке и фосфорилирования по тирозину белков клеточной стенки.
Таким образом, нами показано, что быстрые и значительные изменения активности и состава лектинов клеточной стенки при действии низких температур зависят от кальциевой сигнальной системы и могут быть связаны с участием лектинов в проведении сигнала внутрь клетки или непосредственно в апопластном пространстве.
Цитоскелет-зависимые изменения активности лектинов
Влияние модификаторов микротрубочек на активность лектинов
Ввиду отсутствия в высших растениях настоящих гомологов интегринов и кадеринов - белков, осуществляющих связь внеклеточного матрикса с цитоскелетом в клетках животных, предполагается, что в качестве молекул, связывающих цитоскелет и клеточную стенку растений, могут выступать киназы клеточной стенки и АГБ (Baluska et al., 2003). Имеющиеся данные свидетельствуют о возможности участия АГБ в проведении сигнала от клеточной стенки к цитоскелету в цитоплазму (Baluska et al., 2003).
Для выяснения связи активности лектинов клеточной стенки и структурной целостности цитоскелета был применен ингибиторный анализ (Тимофеева и др., 1999, 2008; Беляева и др., 2002; Чулкова и др., 2005; Timofeeva et al., 2001, 2003).
Для модификации микротрубочек использовали оризалин. Оризалин, связываясь с микротрубочками, ингибирует полимеризацию тубулиновых белков и вызывает исчезновение микротрубочек (МТ) в клетках высших растений, одновременно препятствуя образованию новых микротрубочек (Morejohn et al., 1987).
Оризалин сортоспецифично повышал активность лектинов клеточной стенки (рис. 10) в корнях и листьях незакаленных растений всех трех сортов. Наибольший эффект ингибитора полимеризации микротрубочек наблюдали у слабоморозоустойчивого сорта Безостая 1 (196%), наименьший - у высокоморозоустойчивого сорта Альбидум 114 (136%).
В закаленных растениях Мирновской 808 и Альбидум 114 активность лектинов под влиянием оризалина увеличивалась меньше, чем в незакаленных, а у Безостой 1 так же, что коррелирует с иммуноцитохимическими данными о стабильности МТ (Хохлова, Олиневич, 2003).
Эти результаты свидетельствуют о связи между лектинами клеточной стенки и структурной целостностью цитоскелета. Возможно, лектины принимают участие в связывании элементов цитоскелета с плазмалеммой и клеточной стенкой. Разрушение микротрубочек может приводить к высвобождению лектинов из плазмалеммы в клеточную стенку и окружающую среду.
Таким образом, если существует зависимость активности лектинов от состояния цитоскелета, логично было предположить, что модификация цитоскелета будет изменять активность лектинов.
Рис. 10. Оризалин-индуцированные изменения активности лектинов клеточной стенки в обработанных АБК корнях трех сортов озимой пшеницы: 1 - Безостая 1; 2 - Мироновская 808; 3 - Альбидум 14
В наших экспериментах на фоне АБК активность лектинов под влиянием оризалина увеличивалась в меньшей степени по сравнению с вариантом без АБК (рис. 10). Наиболее выраженным этот эффект был у сорта Безостая 1. Уменьшение влияния оризалина на активность лектинов под действием АБК, вероятно, связано с тем, что абсцизовая кислота может принимать участие в стабилизации цитоскелетных структур, что согласуется с данными иммуноцитохимических анализов (Хохлова, Олиневич, 2003). Поскольку мембранно - цитоскелетный комплекс является динамичной системой, чувствительной к уровню ионов Са2+ (Марков, Медведева, 1998), и связывание с филаментами цитоскелета ассоциированных с плазмалеммой белков регулируется наличием этих катионов (Aderem, 1997), можно предположить, что эффект АБК опосредован изменением концентрации кальция.
Совместная обработка АБК и низкими температурами растений Безостая 1 и Мироновская 808 приводила к уменьшению влияния оризалина на активность лектинов, наиболее выраженному у маломорозоустойчивого сорта (рис. 10). У Альбидум, наоборот, в этих условиях эффект оризалина усиливался. Вероятно, экзогенная АБК является дополнительным к действию низких температур фактором, повышающим устойчивость растений к холоду через увеличение стабильности тубулинового цитоскелета, лишь в растениях маломорозоустойчивого сорта.
Таким образом, сравнение наших данных о влиянии АБК на оризалин -индуцированные изменения активности лектинов клеточной стенки с результатами иммуноцитохимии (Хохлова, Олиневич, 2003), позволяющими непосредственно наблюдать влияние гормона на стабильность микротрубочек, дает основание для использования изменений лектиновой активности в качестве показателя, отображающего степень стабильности тубулиновых филаментов.
В следующей серии экспериментов изучали влияние картолина на оризалин-индуцированные изменения активности лектинов в корнях отличающихся по морозоустойчивости сортов озимой пшеницы.
Рис. 11. Оризалин-индуцированные изменения активности лектинов клеточной стенки в обработанных картолином корнях трех сортов озимой пшеницы: 1 - Безостая 1; 2 - Мироновская 808; 3 - Альбидум 14
Картолин уменьшал эффект оризалина на активность лектинов клеточной стенки в растениях всех трех сортов, и особенно у Безостой 1 (рис. 11). Принимая во внимание способность АБК оказывать стабилизирующее влияние на цитоскелетные структуры (Хохлова, Олиневич, 2003), можно предположить, что реакция лектинов на оризалин при добавлении картолина также является АБК-опосредованной. При добавлении картолина в среду выращивания закаленных растений наблюдали уменьшение влияния оризалина на активность лектинов клеточной стенки у сорта Безостая 1, тогда как у Мироновской 808 и Альбидум 114 эффект ингибитора полимеризации микротрубочек на фоне картолина изменялся на противоположный (рис. 11). По-видимому, это связано с положительным влиянием картолина на поверхностный аппарат растительной клетки, включающий клеточную стенку, плазмалемму (Хохлова и др., 1990) и цитоскелет.
Известно, что картолин принимает участие в регуляции кальциевого гомеостаза, предотвращая значительные колебания его концентрации в цитозоле (Хохлова и др., 1993). Это также может быть одной из причин стабилизирующего влияния картолина на микротрубочки, что и нашло отражение в уменьшении эффекта оризалина на активность лектинов.
Влияние цитохалазина Б на активность лектинов. Как известно, реорганизация актинового цитоскелета является необходимым условием развития морозоустойчивости растений (Quellet et al., 2001; Хохлова, Олиневич, 2002). Часть одиночных периферических микрофиламентов располагается в промежутке между кортикальными микротрубочками и параллельно им, связываясь с ними латеральными мостиками. Другие кортикальные микрофиламенты связаны с плазмалеммой одним плюс-концом и отходят от неё под разными углами (Васильев, 1996). В результате система периферических микрофиламентов оказывается заякоренной на плазмалемме, а через микрофиламент-связывающие белки - на клеточной оболочке (Williamson, 1993).
Ингибитор полимеризации актиновых белков цитохалазин Б относится к группе антибиотических веществ грибного происхождения. Он обнаруживает сходство с кэпирующими белками, связывается с плюс-концом микрофиламента, блокирует полимеризацию, что в конечном итоге приводит к разборке фибриллы. Обработка цитохалазином Б подавляет полимеризацию и функционирование актиновых филаментов (Заварзин и др., 1992).
Цитохалазин Б так же, как и оризалин, вызывал повышение активности лектинов клеточных стенок в корнях незакалённых проростков всех трёх сортов озимой пшеницы (рис. 12). При этом в корнях эффект ингибитора был наибольшим у сорта Безостая 1 (150%) и наименьшим у Альбидум 114 (131%). Эти результаты исследований демонстрируют, что активность лектинов клеточных стенок также зависит от структурного состояния микрофиламентов.
Чувствительность лектинов к цитохалазину Б была в основном меньше, чем к оризалину (рис. 10-12), что может быть обусловлено меньшим содержанием кортикальных микрофиламентов по сравнению с кортикальными микротрубочками в клетках исследуемых растений. С другой стороны, возможно, что кортикальные микрофиламенты менее чувствительны к действию разрушающих агентов, чем микротрубочки.
Закаливание низкими температурами усиливало влияние ингибитора полимеризации актиновых белков на активность лектинов клеточных стенок у сорта Безостая 1 (200% против 150% без закаливания) (рис. 12). В этих же условиях у морозоустойчивых сортов происходило снижение эффекта цитохалазина Б.
Наблюдаемое в наших опытах уменьшение эффекта цитохалазина Б на активность лектинов клеточных стенок в адаптированных растениях морозоустойчивых сортов свидетельствует о положительном влиянии низкотемпературного закаливания на стабильность периферических микрофиламентов.
Обработка АБК незакаленных растений усиливала влияние цитохалазина Б на активность лектинов клеточных стенок в корнях Безостой 1 и Мироновская 808, тогда как в корнях Альбидум 114 АБК подавляла вызванные цитохалазином изменения активности лектинов (рис. 12). Увеличение эффекта цитохалазина на активность лектинов клеточной стенки может быть связано с деструктирующим действием гормона на актиновый цитоскелет (Eun, Lee, 2001; Хохлова, Олиневич, 2003). Вероятно, АБК, оказывая влияние на процесс фосфорилирования актинсвязывающих белков, изменяет степень полимеризации микрофиламентов и, как следствие, взаимодействие лектинов клеточной стенки с плазматической мембраной.