Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
ЛЕКТИНЫ КАК АКТИВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ УСЛОВИЯМ СРЕДЫ
Тимофеева Ольга Арнольдовна
03.00.12 - физиология и биохимия растений
Уфа - 2009
Работа выполнена на кафедре физиологии и биотехнологии растений ГОУ ВПО Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Шакирова Фарида Миннихановна
доктор биологических наук, профессор
Каримова Фатима Габдуллазяновна
доктор биологических наук
Соколов Олег Игоревич
Ведущая организация: Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск
Защита состоится « 12 » ноября 2009 г. в 14 часов на заседании диссертационного Совета Д 212.013.11 при Башкирском государственном университете по адресу: 450074, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32, биологический факультет, ауд. 332, факс (347)-273-67-78; e-mail: disbiobsu@mail.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета
Автореферат разослан «__» _______________ 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д212.013.11,
доктор биологических наук, профессор М.Ю. Шарипова
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. В последнее время система углевод-белкового узнавания рассматривается как дополнительная к генетическому коду. В пептидах и олигонуклеотидах информация кодируется соответственно числом аминокислот или нуклеотидов и их последовательностью, тогда как в случае углеводных структур информация кодируется не только числом и последовательностью углеводных остатков, но также их аномерной конфигурацией и порядком связи друг с другом. Благодаря этому, углеводные цепи обладают уникальными возможностями в плане кодирования информации. Лектины имеют замечательную способность выбирать из всего разнообразия углеводных структур только определенные и, таким образом, воспринимать информацию, зашифрованную в углеводных структурах. Последующее связывание лектина с углеводным рецептором приводит к изменению сигналов в данной биологической системе (Belogortseva et al., 1998).
В настоящее время существование в клетках животных специфической лектинзависимой системы регуляции клеточных функций не подвергается сомнению. Предполагают существование подобной системы и в растениях.
В литературе накоплено достаточно данных, свидетельствующих об изменении активности лектинов под влиянием различных стрессорных факторов и возможной роли этих белков в формировании неспецифических защитных реакций растений. Имеются сведения о значительном повышении гемагглютинирующей активности лектинов при поранении (Любимова, 1991), воздействии низких температур (Комарова и др., 1999), усилении синтеза и повышении уровня лектинов при инфицировании фитопатогенами (Gibson et al., 1982; Шакирова и др., 1990; Шакирова, 1999), гипертермии (Spadoro-Tank, Etzler, 1988; Шакирова и др., 1995; Shakirova et al., 1996), засухе и осмотическом шоке (Cammu et al., 1989), засолении среды (Шакирова и др., 1993), а также об индукции экспрессии генов лектинов при дефиците влаги (Singh et al., 2000), раневом (Zhu-Salzman et al., 1998) и солевом (Zhang et al., 2000) стрессах. В то же время известно, что лектины являются многофункциональными белками, участвующими в различных ферментативных, рецепторных, транспортных и других процессах (Ferens-Sieczkovska et al., 1989; Gordon et al., 1998; Clark et al., 1999; Van Damme et al., 2004; Шакирова, Безрукова, 2007).
Однако, несмотря на интенсивное изучение функций лектинов совершенно отсутствуют данные о механизмах регуляции их активности.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выяснение механизмов регуляции активности лектинов при действии на растения пшеницы стрессорных факторов биотической и абиотической природы.
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
изучить изменения активности и молекулярной гетерогенности лектинов в листьях и корнях проростков озимой пшеницы при действии на них низких положительных температур в процессе закаливания;
исследовать динамику изменений активности лектинов в проростках пшеницы при микоплазменной инфекции, совместном действии на растения низких температур и инфекции, действии салициловой кислоты и инфекции;
изучить действие регуляторов роста на показатели активности лектинов, митотической активности клеток и морозоустойчивости растений пшеницы, различающихся по степени морозоустойчивости;
выяснить эффект ингибиторов кальциевой сигнальной системы на активность и состав лектинов при гипотермии;
изучить влияние структурных модификаторов микротрубочек (оризалина) и микрофиламентов (цитохалазина Б) на активность растворимых и связанных с клеточной стенкой лектинов в листьях и корнях у разных по морозоустойчивости сортов озимой пшеницы при действии низких температур;
определить связь между изменениями в структуре цитоскелета и митотической активностью меристематических клеток в корнях пшеницы.
Основные положения, выносимые на защиту.
· Изменения активности лектинов проростков пшеницы при действии на них биотических и абиотических факторов среды имеют сходный характер, что свидетельствует о неспецифичности данной ответной реакции.
· Уровень активности лектинов, связанных с клеточной стенкой, коррелирует со степенью морозоустойчивости сортов озимой пшеницы.
· Быстрые изменения активности и состава лектинов клеточной стенки, обусловленные функционированием кальциевой сигнальной системы, являются начальным этапом формирования неспецифического защитного ответа растений.
· Активность лектинов зависит от состояния цитоскелетных структур. Увеличение активности лектинов клеточной стенки, опосредованное процессами динамической нестабильности микротрубочек и микрофиламентов, необходимо для формирования адаптационных процессов и повышения устойчивости растений.
Научная новизна работы. Впервые показано, что лектины клеточной стенки представлены несколькими полипетидами, различающимися по молекулярной массе. При действии на растения низких температур происходят существенные изменения в составе лектинов клеточной стенки.
Впервые выявлен фазный характер изменений в активности лектинов в проростках озимой пшеницы при действии на них биотических и абиотических факторов внешней среды.
Впервые показано участие мембранных кальциевых каналов в регуляции активности и молекулярной гетерогенности лектинов клеточной стенки.
Впервые обнаружена сорто- и органоспецифичная зависимость между уровнем активности лектинов клетки и структурным состоянием цитоскелета.
Впервые продемонстрирована возможность регуляцмм активности лектинов клеточной стенки путем воздействия на растения фитогормонами и их структурными аналогами. Впервые показано, что салициловая кислота снимает изменения активности лектинов, индуцированные микоплазменной инфекцией.
На основании полученных результатов предложена схема участия Са2+-сигнальной системы и цитоскелетных структур в регуляции активности лектинов при формировании адаптивных реакций растений.
Научно - практическая значимость работы. Выявленные субклеточные и молекулярные механизмы адаптации и устойчивости растений к абиотическим стрессовым факторам среды представляет значительный интерес для создания и скрининга новых сортов и форм растений, более приспособленных к нестабильным условиям внешней среды. Установление коррелятивных зависимостей между активностью лектинов клеточной стенки и морозоустойчивостью растений озимой пшеницы позволяет использовать лектины в качестве высокочувствительных молекулярных биодиагностикумов, характеризующих термоадаптивный потенциал и морозоустойчивость растений разных генотипов озимой пшеницы.
Помимо этого, полученные данные могут быть использованы в учебном процессе при чтении соответствующих разделов по физиологии и биохимии растений.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на международном симпозиуме «Cereal Adaptation to Low Temperature Stress in Controlled Environments» (Hungary, 1997), на Международном симпозиуме «Plant Cytoskeleton: Molecular Keys for Biotechnology” (Ялта, 1998), на II международной конференции «Progress in Plant Sciences: from Plant Breeding to Growth Regulation” (Hungary, 1998), на ІІ (X) съезде Русского ботанического общества «Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков» (Санкт-Петербург, 1998), на Всероссийских съездах Общества физиологов растений России (Москва, 1999; Пенза, 2003; Сыктывкар, 2007), на пятой международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1999), на международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в 21 веке» (Сыктывкар, 2001), на международном симпозиуме «Plant under Environmental Stress» (Москва, 2001), на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на международном симпозиуме «Plant Cytoskeleton: Functional Diversity and Biotechnological Implications» (Киев, 2002), на международной научной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003), на всероссийской конференции «Актуальные вопросы ботаники и физиологии растений» (Саранск, 2004), на Всероссийской конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), на 1 и II международных научно-практических конференциях «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004; Казань, 2008), на международной научной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия (Вологда, 2005), на втором международном симпозиуме «Signalling Systems of Plant Cells: Role in Adaptation and Immunity» (Казань, 2006), на международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008) .
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 57 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, изложения экспериментального материала и его обсуждения, заключения, выводов и библиографии, включающей 305 наименований, из них 145 - на русском языке. Работа изложена на 287 страницах машинописного текста, содержит 60 рисунков и 11 таблиц.
Личное участие автора в получении научных результатов. Личный вклад соискателя заключается в разработке идеи работы, в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.
Благодарность. Выражаю благодарность д.б.н., проф. Хохловой Л.П. за помощь в выполнении данной работы.
лектин реакция пшеница клетка
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследований служили проростки озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) трех отличающихся по морозоустойчивости сортов: Безостая 1 - маломорозоустойчивый, Мироновская 808 - среднеморозоустойчивый, Альбидум 114 - высокоморозоустойчивый сорт.
Растения выращивали в лабораторных условиях в кюветах на водопроводной воде при освещенности 100Вт/м2 и 12-часовом фотопериоде. Закаливание 7-суточных проростков озимой пшеницы проводили в термокамере в течение 7 суток при 30 С. В течение процесса низкотемпературного воздействия отбирали пробы для определения активности и фракционного состава лектинов клеточной стенки.
Инфицирование микоплазмами (Acholeplasma laidlawii 118), выделенными из пшеницы, проводили на семидневных проростках озимой пшеницы Мироновская 808. Культура микоплазм была выращена сотрудниками Лаборатории молекулярной генетики (КИББ КНЦ РАН). Инфицирование растений проводили инъекцией с помощью микрошприца в нижний участок стебля по 5 мкл культуры A. laidlawii с исходным титром 105 КОЕ/мл. Проверку на зараженность растений микоплазмами проводили методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Часть инфицированных растений переносили в холодильную камеру на закаливание при 20 С. В течение 7-ми суток, следующих за процессом инъекции микоплазмами, брали листья и корни проростков пшеницы для определения изменений активности лектинов в процессе инфицирования.
Салициловую кислоту (10-5 - 10-3 М) вносили в среду выращивания 4-х дневных проростков озимой пшеницы Мироновская 808.
Ингибиторы потенциал-зависимых кальциевых каналов дилтиазем (250 мкМ) и верапамил (250 мкМ), ингибитор фосфолипазы С неомицин (100 мкМ), антагонист кальмодулина хлорпромазин (250 мкМ), ингибитор фосфоинозитольного цикла LiCl2 (1 мM) добавляли в среду выращивания 6-дневных проростков. Через сутки 7-дневные опытные растения помещали на 7 сут в низкотемпературную камеру (20 С). Концентрации ингибиторов были подобраны в предварительных экспериментах.
В экспериментах с Са2+ растения озимой пшеницы выращивали на бидистилированной воде с добавлением Са2+ (25 мкМ и 1 мМ) или без него.
Структурную модификацию цитоскелета осуществляли in situ путем введения в интактные ткани растений ингибиторов полимеризации тубулиновых и актиновых белков - оризалина и цитохалазина Б, соответственно (Хохлова и др., 1997). Растворы оризалина (корни - 10 мкМ, листья - 15 мкМ) и цитохалазина Б (корни - 10 мкМ, листья - 15 мкМ) вводили в ткани листьев путем вакуум-инфильтрации в течение 20 минут, а в ткани корней - путем инкубации в течение 3 часов. В контрольном варианте ткани инфильтрировали (листья), либо инкубировали (корни) в бидистиллированной воде.