Материал: Konspekty_Enzimologiya

Образуется некая модифицированная форма ф-нта несущая группу, оторванную от 1 S и потом на 2S передающаяся

Имеем суперпозицию 2х реакций: 1- по своему механизму

2- по своему, только у нее исх конц фермента будет «фермент, модифицированный в первой реакции» Его конц невысокая но мы работаем в условиях стационарности т.е. его конц будет постоянной

Вспомним жуткое уравнение

Оно почти такое же будет, только исчезает произведение констант Ks(A)*Km(B)

Некое суммированное уравнение М-М Если теперь сделаем то же

1/v=

нас тройной комплекс или нет. Один из тех редких случаев, когда кинетические данные дают ответ.

Дальше – то же самое т.е. можем ввести некое замещение члена на каждую величину: получить ее значение в виде точек, дальше построить вторичный график 1/ wmax от 1/w и получить Зная макс скорость, можем Км рассчитать.

В случае пинг-понга у нас в отл от тройного комплекса ,присоединение субстратов строго задано, один - строго донор и должен отдавать свою часть, а второй может присоединять только после первого, иначе не пойдет реакция.

Есть реакции и 3-х и 4-х субстратные. 3-х – аминоацил-тРНК-синтетаза

Более высокого порядка нет - слишком медленная кинетика из-за диффузионных задержек.

Если мы рассмотрим реакцию, которая идет не по механизму пинг понга, присоединение каждого S обратимо и собрать полностью комплекс из трех или четырех компонентов затруднительно.

{Пируватдегидрогеназный комплекс это комплекс там кинетика осложняется} Встречается редко – означает что они малоудобны и есть только тогда когда неизбежны,но также с ними трудно работать.

В новосибирске с аминоацил….

страница в журнале исписана вся стрелочками, очень много реакций и вариабельности процессов изменяющаяся в факториальном значении Нужны не мозги, а компьютерные программы.

Многостадийные реакции

Суть: когда фермент присоединяется к S, мы пишем с вами обычно просто ферментсубстратный комплекс, подразумевая, что это некое единое состояние.

Реально – более сложная система: фермент с S и дальше какие-то перестройки Из курса б/х знаем, как S присоединяется: где-то протонирование, где-то депротонирование. И в таком состояние они могут находиться довольно долго.

Это не значит, что они существуют и мы можем их выделить, они живут меньше 1мс, но они есть. Тогда реакция идет по другой схеме Здесь появляются лишние константы. И понятно что их появление немного усложняет

ситуацию, дополнительные члены которые выглядят как некое дополнительное произведение констант.

Более сложное уравнение, которое в случае быстрого протекания не сильно будет отличаться от обычной реакции, т.к. эти константы будут очень маленькими.

В тех случаях, когда эти комплексы реально долгоживущие, это становится заметным и сказывается на уравнении реакции. Определить можно только тогда, когда можно идентифицировать разные фермент-S комплексы, а это не всегда возможно.

Чарлз на пероксидазе – есть внутренний зонд – гем – с-ма сопряженных связей может образовать несколько комплексов. Свободный гем и гем в комплексе имеют разные спектры поглощения.

Используя разницу различных форм гема в т.ч. и в ходе реакций Чарлзу удалось показать,что такие формы существуют какое-то время и надо это учитывать в кинетике. Метод дифференциальной спектроскопии для цитохромов и расшифровать т.о. ЭТЦ. спектр – они относительно похожи суспензия – все накладывается

А если восстановленную форму как опытная кювета и сравниваем контрольной окисленной – получим дифференциальный спектр и он добавлял в кюветы разные восстановители суспензии мтх и видел прям в суспензии, какие цитохромы окисляются, а какие восстанавливаются в зависимости от того, какой субстрат дают.

НАД и сукцинат через разные точки

Отклонения от нормальной кинетики – промежуточная форма есть, надо иметь в виду это.

Период реакции в нестационарном состоянии.

Для того чтобы выразить конц ФСК, предполагаем,что она остается неизменной и работает только на том участке, где кол-во продукта линейно зависит от времени. Ход кривой отражает постепенное нарастание концентрации ФСК

если мы прямой участок продлим – характеристическая точка, которая будет равна величине обратной Кд ФСК. Ее измерить трудно, требует времени. А время в мс меряется значит нужны методы стационарной кинетики

Проблема - надо смешать механически компоненты, требует времени. Перемешивание палочкой – десятки секунд, реакция нас обгонит.

Подходы:

1) быстрое смешение и быстрая фиксация рез-тата:

–имеется некая стационарная кювета на входе имеется интенсивно смешивающий 2 струи механизм – воронка с ребрами в кот под большим Р впрыскиваются растворы реагентов: буфер с ферментом и субстрат с кофактором.

–вместо кюветы – длинная трубка, в кот раствор течет непрерывно

подача идет под высоким Р и скорость потока постоянна и очень высока. Если здесь смешение t=0 t=1*10^-3 , 2*10^-3 и т.д. Детектор – степень поглощения или флуоресценцию. Не для всех реакций можно провести те реакции, которые не позволяют фиксировать изменения оптическими методами и, как правило, непригодны. Были использованы изоэлектрические методы – неудобно.

2) меряем не скорость протекания реакции, а скорость достижения равновесия при смене условий. Если имеем реакцию у нее имеется свои темп зависимости для каждой конкретной стадии.

если меняется t, равновесные компоненты меняются – типичная тд

если возьмем некую смесь, в которой установилось равновесие, поместим в кювету, в которой будет непрерывное измерение оптического параметра. Затем резко нагреем и резко охладим. С-ма в состояниях смещения равновесия. Переход в равновесие начнется – более высокая скорость в одном направлении и более медленная в другом. метод температурного скачка, достигается 2-мя подходами:

-микроволновое излучение

-гальванические (?) какие-то другие были ячейки, которые позволяют как повышать, так и понижать температуру.

В любом случае температурный скачок должен иметь разумные пределы, не должен превышать тот предел, при котором фермент уже не будет работать. Т.е. диапазон примерно 20 градусов.

Ингибирование.

С точки зрения кинетики 2 случая, которые обозначаются разными терминами (ингибитор и активатор) - это одно и то же.

Кроме особых случаев, когда активатора может не быть. Все ингибиторы делят на 2 гр: обратимые и необратимые. Это все условно:

1)есть случай когда ингибирование вроде необратимо, но в принципе есть небольшое медленное обращение, но детектировать можем. Получить восстановленный фермент не удается.

2)есть некий процесс дополнительный, который из необратимого делает обратимое ингибирование – реактивация.

Обратимое ингибирование:

Вещество может образовывать комплекс с ферментом, который дальше может диссоциировать.

Необратимое – когда К=0 Для того чтобы это узнать надо определить К, а их определение зависит от способа ингибирования.

Нужен эмпирический способ определения обратимости ингибирования: он обратим, если после взаимодействия с ферментом он может быть удален из комплекса путем диализа или гель-фильтрации. Но и здесь возможны неоднозначные случаи: иногда К связывания ингибитора велика и диализ стремится к бесконечности.

Ингибиторы весьма разнообразны и сильно отличаются по тому, на что они конкретно воздействуют.

1 группа – Неспецифический ингибитор моментально прекращает реакцию путем денатурации фермента. Это сильные кислоты и основания, сильные детергенты ионные. Действие неспецифично и не особенно интересно.

2 группа - ингибиторы взаимодействуют непосредственно с ферментом. Разнообразие здесь