Материал: Konspekty_Enzimologiya

Сначала разделение проводили в жидкостях, потом стали делать это в гелях, чтобы можно было получать отдельные области (без диффузии, конвекции и тп). Гели делали из крахмала, в гелях вырезали лунки, потом гель красили (использовались красители, применяемые в текстильной промышленность для покраски шерсти).

Первый электрофорез белков был сделан в плазме крови.

Потом стали использовать крахмальные гели. Но это было не очень хорошо, потому что крахмал - природное вещество, которое нельзя получить в чистом виде. Уроновые кислоты (примеси в крахмале, выделенном из растений) в этом случае выступают в качестве неподвижных молекул. Тогда наблюдается движение растворителя вокруг них -> явление электроэндоосмоса - размывание зон.

Суть электроэндосмоса в том, что, если в геле иммобилизованы анионы, то в электрическом поле они очень хотят течь к аноду, но не могут. Зато противоионы (обычно протоны) могут течь в обратную сторону- к катоду. Они увлекают за собой молекулы растворителя, и появляются направленные токи жидкости, которые тащат разделяемые молекулы туда, куда нам не нужно. (Странное объяснение, ничего не понятно, при чем тут иммобилизированные ионы).

Поэтому гели НЕ ДОЛЖНЫ БЫТЬ ЗАРЯЖЕНЫ! (Но вот агарозные гели для электрофоретического разделения НК вполне себе заряженные)

Далее - акриламидные гели. В акриламиде СН2=СН—CONH2 есть этиленовая группировка, которая вступает в радикальную полимеризацию => образуется цепочка. Для сшивки цепей между собой используют N,N-метилен-бис-акриламид (СН2=СН—

CONH)2-СН2. Частоту этих сшивок (долю плотной матрицы) мы можем варьировать, меняя концентрацию метилен-бис-акриламида.

Длину цепей тоже можно варьировать за счет изменения концентрации персульфата (чем она выше, тем больше центров полимеризации => тем короче длина цепей). После долгого хранения геля в растворе происходит гидратация амидных групп и гидролиз геля. Гель приобретает анионы, и действует явление электроэндоосмос. Раствор акриламида обычно готовят заранее и хранят в концентрированном виде (30%).

В гель обязательно добавляем персульфаты H2S2O8 (чаще всего персульфат натрия) - источник радикалов. Они ускоряют полимеризацию геля. PSA лучше долго не хранить. Без них невозможно быстрое использование геля в лаборатории. А вот кислород мешает полимеризации геля - он выступает в роли гасителя свободных радикалов (пероксид-радикал довольно стабилен). Поэтому гель не заливают в плоскую форму, а заливают между двумя пластинами, ограничивающими его контакт с кислородом. Еще добавляют TEMED (N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин) - он инициирует полимеризацию.

Теперь делают плоский гель.

Стартовая ситуация: белки находятся в растворе.

Если делаем форез в трубке:

Берем акриламидный гель и создаем на нем три зоны с разным значением pH:

1.8.3. Тонкая полоска в начале, нужна только для того, чтобы смесь белков вступила в электрофорез. Трис-глициновый буфер

2.6.8. Концентрирующий слой. Белки здесь двигаются свободно. Трис-HCl

3.8.8. Разделяющий слой. Трис-HCl

Вэлектродном буфере pH=8,3 мы имеем более медленные ионы глицина (они почти все анионы при таком pH), в концентрирующем геле быстрые маленькие Cl-. Когда включаем, под действием электрического поля хлорид-ионы движутся к аноду (+), оставляя за собой бедное ионами пространство. Это приводит к резкому падению напряжения (хорошо бы понять как). Просто становится меньше подвижных ионов При снижении концентрации ионов падает электропроводимость по з-ну Кольрауша. В результате возникшего перепада напряжения “медленный” глицин начинает ускоряться, догоняет хлорид, и в дальнейшем движется с такой же скоростью. А подвижность белков где-то средняя, они тоже начинают быстрее двигаться из-за перепада напряжения, затем натыкаются на мелкое сито разделяющего геля, сзади их еще подпирает глицин => тонкая полоска образца.

При pH=6,8 глицин не заряжен.

Для препаративного фореза внизу стекла можно поставить полупроницаемую мембрану и постоянно экстрагировать выходящий из геля раствор.

Вэтом методе идет игра на изоэлектрических точках белков.

Применение электрофореза: для анализа сложной смеси или как критерий чистоты. Хорошо делать 2 фореза в разных условиях рН и применять еще какой-нибудь метод потом для выявления минорных примесей.

Форез не определяет абсолютных свойств белка. Но это денатурирующие условия, поэтому :

-может быть разная длина с нативной молекулой

-может быть разное связывание с SDS (т.е. разный собственный заряд белков,например, как у гистонов)

-структура иногда может разрушаться или связываться не так ( например, p50)

10.11.15 Разделение в градиенте рН, 2 применения электрофореза: препаративный и аналитический, изотахофорез, двумерное разделение, выделение белка из сложной смеси. Характеристики очистки белка.

Изоэлектрическая точка белка - рН, при котором он перестаёт двигаться в электрическом поле.

Каждый ион при градиенте рН создает свою буферную емкость.

Амфолины - носители, представляют собой смесь полиаминополикарбоновых кислот, которые содержат группы с разными областями рК.

В электрическом поле происходит разделение, положение будет эквивалентно рК.

Из-за перекрывания областей рН возникает непрерывный устойчивый градиент, выстраивать специально молекулы не нужно - сами делают это.

При движении частиц возникает сильный ток. Когда ток большой при небольшом напряжении - происходит сильный нагрев. Есть другой случай - при высоком напряжении небольшой ток.

Часто делают просто сухие гели, которые заливают амфолинами. Чтобы белок не размывался, его наносят на хроматографическую пластинку и кладут сверху на гель. Непонятно, сколько времени надо, для достижения рI, поэтому вносят маркеры с известными значениями ( например: гемоглобин, цитохром). Маркеры вносят на противоположные концы геля. Когда точки сойдутся - форез закончен.

Применение :

1)Аналитический метод - определение гетерогенной смеси (или чистоты препарата). Можно хорошо разделить изоформы.

2)Препаративный метод

Окрашивание проводить очень внимательно, потому что амфолины красятся теми же в-вами, что и белки. Проведение разделения проводить при охлаждении ( так как диффузия и др.). Также мешают конвекционные токи, чтобы избежать их воздействия делают раствор амфолинов в глицерине (или сахаре). Еще можно использовать Сефадекс (мелкопористый).

Также с помощью глицерина можно повысить растворимость белка, она будет минимальная в изоэлектрическом точки,а из-за этого будут размываться зоны.

Изотахофорез

В данном случае заряженные группы у нас только у амфолинов, но они не выстраиваются в цепочку, а постоянно двигаются. Возникает дефицит зарядов. Получается так, что полосы белков отделены полосами амфолинов.

Чем выше заряд, тем выше будет скорость движения белков.

Это метод разделения ионов по их подвижности в электрическом поле. Все ионы движутся в одну сторону, впереди идут супер-подвижные амфолины, сзади супермедленные, а где-то между ними исследуемые ионы. Чтобы исследуемые белки не слиплись в одну полоску между быстрыми и медленным амфолинами, вводят амфолин с промежуточной подвижностью, который будет разделять белки, и мы увидим полоски.

Двумерное разделение

В первую очередь проводим расщепление белков на пептиды. (трипсином например) Далее есть три варианта разделения:

1) на хроматографической бумаге Слево направо - форез, сверху вниз хроматографическое разделение.

2) в трубках Разделение от рН3 до рН 9.

Для сложных смесей белков используют повторное разделение в направлении, перпендикулярном первому. Например, полоску геля после разделения изоэлектрофокусированием, накладывают на край ПААГ, содержащего ДДС-Na (SDS) и проводят электрофорез в перпендикулярном направлении. Таким образом, в первом направлении белки разделяются в соответствии с их изоэлектрическими точками, а во втором – в соответствии с размерами субъединиц. Этот метод позволяет провести одновременное разделение до 5000 белков.

3) без фокусировки

Выделение белка из смеси:

1.Много материала - много балласта. Решение: удаление крупных компонентов, которые увеличивают вязкость.

2.Сокращение объема смеси. Решение: осаждение.

3.Ионно-обменная хроматография. Лучше две в разных условиях.

4.Гель-фильтрация (обычно на последних стадиях!) или гидрофобная хроматография.

5.Хроматофокусирование

Не забывать о тот, что после всех манипуляций активность должна остаться прежней. Составляем таблицу данных.