Материал: Konspekty_Enzimologiya

-у белка нет постоянного заряда. Нужно подобрать такой рН, при котором наш белок будет связываться с колонкой, а остальные - нет. В зависимости от рН можно делить и на катионообменниках, и на анионообменниках.

-ионообменная хроматография - обладает высокой емкостью. Слишком большая плотность заряда - плохо, а то белок может прилипнуть навсегда - многоцентровое связывание. Количество центров может меняться в зависимости от условий среды.

На рисунке показано, что при разных рН может быть разная последовательность элюирования разделяемых белков.

Буфер надо брать того же заряда, что и ионобменник (=у него должна быть ионогенная группа, не связывающаяся с обменником иначе изменится рН).

На связывание влияет ионная сила.

Суспендируют в Buf, инкубируют, переносят на колонку. Колонку белком заполняют обычно на треть, максимум на две трети, т.к. насыщение - плохо.

мг/экв - емкость ёмкость ионообменника стандартно указывают по альбумину или гемоглобину.

Весовая единица белка - ориентир для загрузки колонки Неспецифическая сорбция (часто связывается с целлюлозой) - предварительная забивка проводится сывороточным альбумином.

Колонку промывают до почти нулевого уровня выхода белка, т.к. неспецифическое связывание. После разделения нужно быстро довести рН до оптимального для нашего белка.

Элюция градиентом рН (в пределах устойчивости белка и оптимального его существования) - редко используется, так как приходится менять буфер. Элюция градиентом соли - “мешающие ионы”.

Чем выше ионная сила, тем выше время существования белка без связей с носителем. Это определяется концентрацией соли. Разные белки элюируются разной концентрацией соли.

При ионообменной хроматографии на целлюлозе пики немного размываются. Повышение концентрации соли:

1)Ступенчатое изменение - несколько растворов с разной концентрацией - просто и быстро. Но за счет резких скачков - менее эффективное разделение (1

фракция - несколько белков). 2) Непрерывное изменение:

-смешиваем 2 раствора, используя равенства втекающих и вытекающих растворов. Получается экспоненциальная кривая изменения концентрации (колба Бунзена).

-бывает более сложная система: 2 сообщающихся сосуда с растворами разной концентрации, открываем между ними краники. Концентрация возрастает линейно. Если сосуды разные, то получается выгнутая или вогнутая кривая изменения концентрации.

-когда у нас есть сложные смеси, используется более сложное оборудование: 2 сосуда с растворами и многоканальный насос. По определенной программе насос подает определенное количество раствора из 1 и 2 сосудов. Используются level-сенсоры (контроль концентрации белков на выходе). Каждый пик выходит на определенной концентрации соли. Эффективное разделение - до 20 белков.

Плюсы ионообменной хроматографии - большая ёмкость, качество деления мало зависит от параметров колонки.

20.10.15 Гель-фильтрация (проникающая хроматография).

www.ibmc.msk.ru%2Fcontent%2FEducation%2Fw-o_pass%2FMMoB%2F3a.pdf

В колоночной хроматографии важно собрать всю фазу сразу - для этого делают специальное дно => можно повысить площадь сечения колонки => понизить время деления.

Гель-фильтрация

В качестве неподвижной фазы используют гранулы геля с различным диаметром пор. Не подвергаем белок изменениям со стороны среды. Белки в зависимости от размера застревают в разных порах, в разных гранулах.

Чем больше молекулы, тем быстрее они выходят. За счет многократного перехода между гранулами: большие молекулы выходят в объеме V0 (небольшом), маленькие молекулы выходят в объеме, приблизительно равном объему колонки.

Чем больше поры, тем бо́льшие молекулы можно делить.

Более рыхлые гели - для белков, полисахаридов, редко - для НК (для них нужны слишком большие поры в геле, он мнётся).

Матрицы:

-Sephadex - Separating Pharmacea Dextran - декстрановые гели (сшивки - трехуглеродные фрагменты со спиртовой группой посередине -

эпихлоргидрин).

Wiki: Эпихлоргидрин (хлорметилоксиран) — органическое вещество, хлорпроизводное окисипропилена, с формулой СH2-O-CH-CH2Cl.

Эпихлоргидрин получают из пропилена, который хлорируют при температуре 500 °С и давлении 18 атм. до аллилхлорида:

Затем аллилхлорид подвергается действию хлорноватистой кислоты и получают изомерные дихлоргидрины глицерина:

Далее на дихлоргидрины глицерина действуют щелочью (NaOH), в результате чего образуется эпихлоргидрин

Образовавшийся эпихлоргидрин отделяют перегонкой с паром и дистилляцией. Также его можно получить восстановлением хлорированного акролеина.

G 10 (сейчас не используют, изначально - для разделения НМС но это дорого и налипает и задерживает материал) 25, 50, 75, 100, 150, 200.

Маркировка обозначает, сколько мл жидкости впитывает 1 г геля. То есть грамм геля G50 впитает 5 мл, а G150 - 15 мл.

- Изначально гель - в виде сухого порошка; при добавлении воды набухает - надо дать ему время на это. Чем выше значение сефадекс, тем больше воды нужно, тем бо́льшие белки можно разделять (около 750 кДа). Используются колонки тонкие и длинные. G200 - мягкий, это плохо, он сминается. Нужно поддерживать давление, но гель все равно спрессовывается, так как верхние слои давят на нижние. G200 используется крайне редко, почти никогда.

Гели не выкидывают, используют их несколько раз.

-ПАА гели (Bio-gel компании Bio-Rad) Р [число]; бывают от Р2 до Р300). Число обозначает верхний предел молекулярной массы в кДа, т.е. Р4 - до 4000 Да, после которого деление прекращается, и всё выходит в исключённом объёме.

-гели из агарозы (bio-gel A 0,5m-150m; число обозначает миллионы Да) - но эти гели уже довольно хлипкие.

-molselect - ПАА-гели (старые венгерские, производства Reanal, сейчас уже не производятся)

-Sepharose (2B, 4B, 6B; число обозначает процент агарозы в геле; мелкопористые гели) - нельзя автоклавировать, поэтому их стали сшивать: 2BCL (cross-linked), 4B-CL, 6B-CL. Стали обладать очень хорошими механическими свойствами.

-S200-1000 можно было делить в т.ч. рестрикционные фрагменты. Большого применения не нашло. 200-400 нормальные белки, а вот 500-1000 - рестрикты и вирусы.

3основных варианта использования гель-фильтрации:

-разделение НМС и ВМС (G-25 или P-2)

Например, делим сульфат аммония и белок: 1)высаливание 2) смена буфера. Белок выходит в той среде, что был на колонке. Разделение молекул по размерам: все пики в ограниченном объёме => можно вносить только немного материала. Колонки должны быть достаточно узкими, чтобы уменьшить диффузию (а не то пики будут широкими и перекроются). Если хотим много белка: повышаем объем колонки, повышаем концентрацию белка в наносимом растворе, но сокращаем объем (колонка может затормозиться). Рекомендованная концентрация - примерно 10 мг/мл (не больше 20).

V0 - довольно заметная величина (20-25%колонки).

Компромисс: при препаративной очистке берут белков примерно 3-5% колонки. В результате гель-фильтрации пик размывается примерно в 3 раза. В общей сложности можем разделить 5-6 пиков. Но нам обычно важно отделить 1, тот самый, желанный, единственный (а что происходит с остальными пиками, нам всё равно).

На выходе можем отслеживать поглощение. Но активность определяем уже во фракциях. Нужно делать это быстро и точно.

Обычно гель-фильтрация проводится на 1 геле. Но бывает полезно проводить ее и на нескольких, например, сначала разделяем кучу мелких белков от кучи больших белков, а потом хотим смесь больших белков (которая оказалась за гранью разрешающей способности геля по массе белков) разделить между собой - берем другой гель, позволяющий разделять в диапазоне бОльших масс.

Гель-фильтрация даёт возможность определить и другие параметры:

-число компонентов