Материал: Konspekty_Enzimologiya
Подход 3:
Используется пресс - “универсальный гомогенизатор”. (гомогенизатор Manton-Gaulin) Есть сосуд с суспензией. Насос подает ее в камеру под давлением, камера занята иглой. Игла отходит на крошечное расстояние, туда проходит немного массы, клетки лопаются. Давление падает, игла встает на место, потому что она толкается пружиной. В итоге колебания давления происходят с ультразвуковой частотой, так что все клетки лопаются. Оптимизация жесткости пружины и скорости подачи материала могут позволить разрушать плазмалемму, а ядра не разрушать. В итоге вязкий хроматин в раствор не попадает.
Проблема использования такого гомогенизатора у бактерий: вязкая ДНК у них в цитоплазме.
Подход 4:
Иногда необходимо более мягкое разрушение: клетки обрабатывают лизирующими ферментами (комплексами ферментов, которые встречаются в природе), например из желудка виноградной улитки (Helix) - Helicase™ или у грибов. Еще толуол для цитоплазматических белков бактерий используют.
BTW, источник лизоцима - белки куриных яиц. Haemophilus influenzae - источник 3 типов рестриктаз.
Сейчас часто используют клонирование генов в удобных продуцентах. Мы можем помещать ген в такое окружение, которое обеспечивает максимальную эффективность трансляции белка.
Что делать после разрушения?
Поместить фермент в условия, где он стабилен:
●рН - меняется при разрушении, активизируются ферменты, меняющие рН среды. Например, разрушается растительная вакуоль - закисление. В мышцах ферменты гликолиза.
●окислительно-восстановительный потенциал - для многих важно сохранение SH групп: добавляют меркаптоэтанол, дитиотреитол.
●объём буфера - необходимо много жидкости - в 2 раза больше массы пробы, нужно в том числе для стабилизации рН. Для сочных объектов - 1:1.
●наличие протеаз - их нужно ингибировать:
○понижением температуры,
○путем связывания активного центра.
■У сериновых протеаз серин в активном центре ингибируют фторангидриды некоторых кислот, например, диизопропилфторфосфат. Но он ещё ингибирует сериновый остаток в холинэстеразе (зарин и зоман - его аналоги), поэтому выдуманы другие, менее опасные ингибиторы сериновых протеаз, например, тот, что на рисунке - бензилсульфанилфторид [или -хлорид]:
■Протеазы других классов (их всего 4) ингибируют синтетическими пептидами (но они дорогие)
●растворимость: часто вводят детергенты для повышения растворимости фермента
●ионная сила
Чтобы осадить клеточные стенки, используют в основном центрифугирование, фильтрование, сепарирование (“горизонтальное центрифугирование”).
При центрифугировании может возникать плохо осаждаемая смесь. И фильтруются такие смеси обычно плохо - фильтрование через силикагель. При центрифугировании удается избавиться от клеточных стенок и от липидов (сливают смесь через крупнопористый мат; липиды остаются на поверхности). Ещё была история про центрифугирование с узкой щелью.
После отделения в растворе остался фермент с целым рядом других веществ.
Как очистить?
2 проблемы: низкомолекулярные вещества и высокомолекулярные вещества.
1) НМС
-удаление путем диализа: раствор помещают в мешок из полупроницаемой мембраны, мешок в некий объем раствора, НМС уходят в раствор; диализный буфер меняют несколько раз - используют этот метод часто. Иногда экстракт уходит, НМС остается.
2) ВМС удаление полифенолов (с помощью капрона, поливинилпирролидона)
Если через капрон отфильтровать растительные клетки, то фенольные соединения застревают, эффективность очищения повышается.
Поливинилпирролидоны - полимеры - для создания градиента центрифугирования - осаждение со всеми клеточными стенками.
Нужно сконцентрировать фермент:
1)переосаждение фермента (также позволяет удалить НМС и ВМС примеси) - очистка в 2-3 раза
2)нужно оторвать водную оболочку, уменьшить воду в окружении:
Добавляют соли: связывают свободную воду, уходит вода от гидрофобных участков, белки агрегируют этими участками и выпадают в осадок
Белки: глобулины (растворимы в растворах с низкой ионной силой), альбумины (растворимы при определённой ионной силе, в чистой воде денатурируют)
Рисунки только про альбумин:
На первой картинке растворимость зависит от того, насколько гидрофобный участок, насколько прочно связывается с водой. На второй на пике - наибольшая растворимость.
13.10.15 Методы осаждения белков: растворителями, высаливанием, термоинактивацией. Катионнообменники и анионообменники.
Осаждение:
1)Солями (связывают воду - осаждают некоторые белки, но не все!). Чаще всего используется сульфат аммония - хорошо растворим (до 4М используют), молекулы большие. Должен быть чистым (прежде всего от тяжелых металлов - железо, свинец и пр). Раствор будет закисляться, что может быть нежелательно для ферментов - нужно контролировать рН.
2)Органические растворители - используются растворители, хорошо смешивающиеся с водой. Важно соблюдать температурный режим, нужна быстрота процесса, гидратация идет с выделением тепла (его нужно отводить) тут будет гидратация? тут разве вода будет присоединяться ?Ацетон и этанол неограниченно растворяются разве если они растворяются, это можно назвать гидратацией, я думала, что гидратацияэто присоединение воды.? . Растворитель добавляем по стенке, по чуть-чуть, в стакане на ледяной бане. Нужна посуда из материала, хорошо проводящего тепло. НЕ используем фарфоровый стакан.
Обычно время добавления выбирают в зависимости от интенсивности
выделения тепла. После добавления - инкубация в течение 5 минут, затем - сразу центрифугировать. После того, как слили растворитель, НЕЛЬЗЯ высушивать белок ДОСУХА! Сливаем растворитель, даем остаткам стечь, затем перерастворяем в большом количестве другого растворителя (часто - ацетон). Или высушиваем под вакуумом.
(Эта картинка не очень точная. Во-первых, должен быть более резкий спад, во-вторых, мы берем условно говоря осадок 4-5 аликвоты (а не 3-4), т.к. 3 еще грязная)
Можно сделать ацетоновый порошок - растворить в большой концентрации ацетона, затем высушить на вакууме - такие порошки могут довольно долго храниться.
При осаждении происходит концентрирование белка. Также освобождаемся от НМС примесей. Но остается соль/растворитель (избавляемся с помощью диализа или гельфильтрации). При осаждении солями в растворе остаются полисахариды и НК.
ДНК (с белками) можно осадить полиэтиленимином (многотоннажный реагент. Добавляется в экстракт после ЦФ-ния. рН 8.0)
Риванол осаждает амилазу специфическим образом. (метод Акабори)
В отличие от высаливания, лучше брать осадок на определение активности.
3) Температурное осаждение (термоинактивация) - используем температуру, подходящую для нашего белка, но денатурирующую остальные белки. Важно быстро нагреть и быстро остудить спустя необходимое время + нужно подобрать подходящие условия - температуру инактивации белка. Используют схему конька-горбунка: сосуд с экстрактом по очереди опускают в 1 - горячую воду, 2 - термостат с
определенно подобранной средней температурой, 3 - ледяную баню. Везде подбираем температуры, подходящие для нашего белка. Важно строго точно поддерживать температуру. Фермент-субстратный комплекс термостабильней свободного фермента. (Вирусы, активирующие ДНК-лигазу выделяли так: до 43 градусов, термостат, потом на крышу.)
Другие методы очистки белка:
1)хроматография
-гель Al(OH)3 или гидроксилапатит (CaOH)3PO4 (позволяет разделить двухнитевые и однонитевые ДНК) - древний метод. Гидроксилы хорошо замещаются на другие ионы, в том числе заряженные группы белка. Разные белки сорбируются с разной прочностью. Первоначально это делали как осаждение - очистка в 508 раз. Промываем фосфатным буфером. Сейчас перешли на колоночную хроматографию. Осаждение теперь используют только для больших объемов.
-ионообменная хроматография - качество деления мало зависит от качества колонки. Первые ионообменники - сульфоугли. Матрицы из сульфопроизводных полистирола - работают почти для всего, кроме углеводов и белков (с белками связываются, как правило, необратимо). Для белков используются гидрофильные матрицы - целлюлоза (лучше