Материал: Konspekty_Enzimologiya

Будут пересекаться в разных местах – не будет точки, которая характеризовала бы данный тип ингибирования.

2)Бесконкурентное ингибирование. Прямые, построенные для разных концентраций ингибитора вообще не пересекаются.

При исследовании механизмов выяснилось, что в данном случае ингибитор влияет на прочность связывания фермента с S и увеличивает прочность связи как субстрата, так и продукта. Таким образом, в одинаковой степени увеличивается Км и уменьшается скорость реакции, поскольку k+3 становится маленькой и возникает параллельность. В эру генной инженерии – возьмем все ферменты, посмотрим, где что можно поменять, покрутить, получим белок с дополнительными группами, которые лучше связывают субстрат. В реальности итог - лучше связывается субстрат, но хуже диссоциирует продукт. И скорость реакции уменьшается, а не растет. Здесь аналогично.

Много таких ингибиторов используется против повышения АД. Ингибиторы приводят к тому, что не формируются определенные типы рецепторов или нет других сигнальных пептидов – менее интенсивная работа ССС, давление понижается.

Ингибиторы протеаз используются при выделении тех или иных белков. Важно подобрать их правильно. Лучше использовать необратимые ингибиторы.

Иногда они нужны на уровне синтеза тех или иных веществ. Нужен продукт, который входит в число нормальных метаболитов, но в клетке не накапливается, потому что превращается далее во что-то еще.

Заингибировав пути превращения, можно получить целевые продукты в более высоких концентрациях.

Механизмы ферментативных реакций.

Как правило – комплексное явление (несколько механизмов), мы их искусственно разделяем.

Ферменты для ускорения реакции используют все возможные параметры:

1.Концентрация субстрата.

Фермент фиксирует в месте реакции субстрат. Если это двухсубстратная реакция (чаще всего, так), и даже если вроде не 2 S, то вторым субстратом может быть вода, которую в кинетике мы не учитываем обычно, но она часто связывается с ферментом в определенной месте водородными связами. Фактически, имеется локальная 100% концентрация реагирующего вещества в месте реакции

2.Энергия

Обычно, на изменение структуры влияет повышение Т, р => более высокая Е столкновения молекул. В ферменте это достигается иным способом, т.к. фермент повысить Т сам не может. Более того, он фиксирует субстраты и поэтому они вообще лишены подвижности, молекулярные превращения исключены. За счет взаимодействия групп фермента и субстрата могут происходить перестройки в электронных оболочках - возможен разрыв/создание связи.

2механизма:

1)Кислотно-основный катализ Осуществляется за счет того, что определенные группы ферментов могут быть

донорами протонов. В субстрате идет перестройка за счет протонов электронной оболочки, поскольку это лишний положит заряд. Как следствие, где-то в другом месте на значительном расстоянии от места присоединения данного протона возникает избыточный положительный заряд, а вернее недостаток электронов, и там протон теряется. Для того, чтобы осуществить такой катализ, нужна группа, которая была бы донором протона в одном месте, была бы акцептором в другом месте.

Иногда процессы настолько быстрые, что мы не можем уловить их даже спектральными методами.

Лизоцим (Феллинг, начало 60-ых годов)

В АЦ этого фермента существуют карбоксильные группы, которые воздействуют на S. Они расположены в АЦ так, что не имеют выхода в окружающую среду, и как правило протонированы. Но могут отдавать протон. Карбоксил Аsp за счет наличия протона атакует (точнее, протон просто идет к кислороду) – разрыв связи. ОН группа на сахаре, на втором – карб-катион. Вторая карбоксильная группа (депротонированная) взаимодействует так, что стабилизирует это состояние за счет оттягивания электронов, т.е. существует еще одно взаимодействие карбоксилов, кислород делается отрицательно заряженным, это стабилизирует структуру. Разрыв связи предшествует присоединению воды, очень часто в реакциях гидролиза. Вода присоединяется на заключительном этапе.

Приходит вода – углерод с кислородом, сахара восстанавливаются и выделяется протон кот соед с карбоксилом. Уходит продукт расщепления, и фермент может присоединять новую молекулу.

схема про гидролиз муреина неверная.

В некоторых случаях протон дополнительно активируется за счет того, что он спрятан в безводной части фермента. Те они изолированы от окружающей среды. В составе белков много различных групп в боковых радикалах, которые могут

осуществлять такого рода катализ. Прежде всего, это различные заряженные группы, например СООAsp, Lys, Arg, имидазольные гр His, Glu.

Имидазол гистидина: здесь имеется некая возможность беспроводной передачи энергии. Кольцо, являющееся сопряженным, фактически трансформирует перенос заряда на другой азот без проблем. И видим часто имидазол в АЦ, участвует как акцептор протона, сдвигаемый за счет того, что свой собственный протон оттягивается на какую-либо другую группу, скажем, на карбоксил. Или же он является донором, поскольку заранее протонирована та группа, которая не должна быть.

Часто бывает так что: СОО, N имидазола, а Н между ними зависает. При необходимости он отдается, поскольку есть водородные связи, он перемещается, а азот отдается и хотя мы пишем систему двойных связей, нужно помнить, что это единая пи-система.

2) Ковалентный катализ

Встреч реже чем К-О. Сериновые протеиназы и эстеразы. В АЦ остаток Ser, вытесняющий спиртовую или аминную группу из связи с карбоксилом и образующий сложноэфирную связь. Пример – трипсин, химотрипсин, суктивизин, холинэстераза.

Сериновый остаток атакует углерод. Параллельно идет активация азота за счет того, что здесь имеется тот самый имидазол. Аспарагиновая кислота своим водородом активирует имидазол, имидазол от азота свой Н передает туда - на пептидную связь. Разрыв связи. Формируется аминная группа, а СО группировка прикрепилась к кислороду серина. Т.о. образовался сложный эфир, где С-концевой остаток образовавшейся аминокислоты ковалентно привязан к ферменту. Присоединяется протон из среды, а дальше вода вступает в реакцию. Протон присоединяется, а ОН вытесняет серин из связи. Имеется карбоксил на конце, причем гидроксил этот из воды, а здесь восстанавливается остаток серина. Ковалентное промежуточное соединение получаем.

Механизм пинг-понга - есть всегда образование ковалентно модифицированного фермента. Пример - пиридоксалевые ферменты участвующие в реакции переаминирования, Активатором реакции могут служат те или иные ионы Ме. Часто оказывается цинк,

который в норме удерживает ОН группа (из воды происходит). Она переносится на другие соединения за счет диссоциации от иона. Так работает карбангидраза. ОН переносится на СО2 ввиду того что есть дефицит электронов. Дальше происходит разрыв связи С=О с образованием бикарбоната.

Цинк обычно координирован тремя азотами, в карбангидразе – это 3 имидазола. Молекула воды взаимодействует с комплексом, распадается, протон уходит в среду, так как бикарбонат обычно достаточно хорошо диссоциирован, и восстанавливается исходное состояние АЦ.

3) В ряде случаев ионы Ме выступают как источники + зарядов. Тогда осуществляется электростатический катализ. (Примеры - цинковые гексозофосфатизомеразы, алкогольдегидрогеназа...)

Также и за счет карбоксильных групп, заряженных аминных групп.

Пример – полимераза НК. 2-3 иона магния, удерживающие ОН. Ионы служат источником активации фосфатов при полимеризации. Они подтягиваются к ионам, между альфа и бета фосфатом возник сопряженная связь за счет дефицита электронов. Присоединение по альфа фосфату группы из сахарного остатка другого нуклеотида. Действует не ион как активатор, а ион как электростатический реагент. Механизмы позволяют передать в систему достаточное количество Е, чтобы проходила реакция.

Существует некая концепция – на самом деле истинным Е является весь фермент. Есть некая конформация, где все остатки связаны. Это создает возможность передачи напряжений по всей структуре. Когда присоединяется S, происходит изменение конформации всего белка. Небольшие изменения в отдельных частях суммируются в одну большую Е. Не доказано окончательно, но есть небольшие пруфы.

То что доказано – фермент стабилизирует переходное состояние реакции.

На заре энзимологии Эмиль Фишер сформулировал принцип, объясняющий высокую специфичность ферментов. Отдельные функциональные группы в S и ферменте расположены так, что они взаимодействуют по принципу ключ-замок. Есть определенные соответствия между ними, так что они могут связываться. Никто не обращал внимания на то, что если фермент и субстрат были бы так сильно подогнаны, то превращения не было бы. Для превращения необходимо, чтобы система стала неустойчивой, и ее можно было сдвинуть в какую-нибудь сторону. Фермент должен связываться в некой напряженной конформации.

В ходе реакции существует переходное состояние, где вроде все атомы связаны друг с другом, но конформация невыгодна. Для водородного обмена – обмен отдельными атомами. Переходное состояние – есть перераспределение электронов. В большинстве известных соединений образуется выворачивание тетраэдра углерода (азота). Три связи в одной плоскости, 4-ая – идет перпендикулярно (а дальше зонтик вывернулся в другую сторону). Вот зачем нужна Еа – чтобы проскочить эту невыгодную структуру.

Можно за счет связывания определенной группы фермента стабилизировать именно эту структуру. Возникла определенная концепция стабилизации фермента, которая быстро получила много подтверждений:

1)Еще до того как придумали концепцию. С лизоцимом. Был карб-катион в 6 чл цикле – форма полукресла – т.е. у него тот атом углерода, что заряжен, находится в той же плоскости, что и 4 соседних атома и только 6-ой атом выходит. В составе лизоцима можно закристаллизовать тот остаток, который был отщеплен там ситуация такая: фермент, связывая часть моносахаридных остатков, вернет связь между 4-ым и 5-ым, 2 с одной стороны, 4 с другой. 2 отвал легко, 4 похуже. Если взять 4х углеродный компонент из муреина, и добавить его в лизоцим то он вместе с ним закристаллизуется прямо в АЦ как он остается после реакции.