Материал: Konspekty_Enzimologiya

первые тоже, но эти связываются в ферменте с определенной химической группой: некоторые ионы тяжелых металлов связываются в ферменте с SH группой и подавляют действие фермента необратимо, как правило. Есть возможность восстановления активности путем добавления конкурентного агента – высокая концентрация сергидридного реагента – сероводород, ртуть в осадок, фермент активен – реактивация. Унитиол - такой серосодержащий препарат для лечения отравлений ртутью.

Еще кулстори - ионы ртути связываются с тиогруппами в аквапоринах, отчего последние инактивируются. В почках через аквапорины реабсорбируется вода => соли ртути оказывают мощное мочегонное воздействие (см. “ртутные диуретики”)

Еще тиогруппы можно связать йодацетатом или йодацетамидом (так ингибируют цистеиновые протеазы).

Существуют еще ингибиторы, кот специфично связываются с разными группами в разных местах белка. Если связь по периферическим группам не важна для катализа, то не обязательно приведет к заметному ингибированию – небольшое влияние на активность.

Избирательное связывание ингибитора в АЦ, то есть специфически связываются с 1 или несколькими группами, характерными лишь для одного фермента или нескольких с похожими АЦ.

сериновые гидралазы, эстеразы (в частности, холинэстеразы нервной системы) Они ингибируют фтор-фосфатными производными. Первый обнаружен -

диизопропилфторфосфат, соединение у которого ОН заменена на фтор, которые легко взаимодействуют с ОН гр в АЦ ферментов связываются с серином и блокируют активность, поскольку этот серин важен для промежуточного связывания.

Еще очень красивая история

https://en.wikipedia.org/wiki/IDFP - по структуре очень схож с нервно-паралитическими ядами, но подавляет моноацилглицерол-липазу, которая является сериновой эстеразой. Моноацилглицеролы - это у нас эндоканнабиноиды. :)

Ингибитор подавляет холинэстеразу – сильный нервно-паралитический яд, с ним опасно работать. С другой стороны – хороший ингибитор протеаз что полезно при выделении др ферментов.

Ингибиторы эти могут использоваться как метки для идентификации АЦ

Модификация этих ингибиторов:

для изопропилфторосфата по двум направлениям:

1)появление нервнопаралитических ядов – гораздо более токсичны.

2)путь разработки таких ингибиторов,которые были бы не опасны. Фенилметилсульфонилфторид:

Фосфатная группа заменена на сульфогруппу, изопропиловый остаток на бензильный, и в результате получается твердое (!) вещество. Почти не токсично.

Оно хорошо ингибирует разные сериновые протеиназы и часто используется в опытах, где выделяются ферменты из источников, в которых протеаз довольно много, т.е. это один из компонентов, который добавляется при гомогенизации ткани для подавления протеолитической активности.

Есть некоторые промежуточные состояния, ингибитор с одной стороны ингибирует на хим гр, но с теми группами, которые в АЦ взаимодействие гораздо быстрее (сергидридные реагенты например)

SН группа в таком окружении, что в реакцию вступает лучше. Можно оттитровать группы АЦ, не затрагивая остальные.

Это все необратимое ингибирование.

Аллостерическое ингибирование.

Существуют определенные ингибиторы, которые связываются с участками фермента, не входящих в АЦ, но меняют его конформацию строго определенным образом, так что АЦ перестает функционировать. Приводит т.о. к конформационным изменениям, понижающим или повышающим (!) активность.

Мб и ингибирование и активация осуществляться разными веществами на одном и том же центре.

Аспартаткарбомоилтрансфераза – первый компонент синтеза пиримидинов – ингибируется Ц и Т (конечным продуктом) – самым дальним и активируется А и Т - индикатор кинетического состояния клетки и концентрации пуринов для поддержания соотношения пуринов и пиримидинов. Центр связывания Ц и Т и А и Т один и тот же. Много АТ, несмотря на наличие Ц и Т фермент будет работать

Кроме этого, существуют ферменты, которые могут взаимодействовать с S. Образования комплекса с S снижает его конц. Если ингибитора много, весь S может быть связан, и реакция не протекает совсем.

Есть ингибиторы, связывающие различные кофакторы ферментов. Все ферменты, содержащие в АЦ такие активные ионы как Mg, Zn, Mn ингибируются ЭДТА. Важным становится то, насколько прочно ингибитор связывает ионы, т.к. в АЦ тоже сильно держит. Соотношение констант играет роль.

Необратимые ингибиторы:

Время,в течении которого фермент будет полностью связан с ингибитором. Ингибитор в смеси - НМС и его молярная концентрация на порядки больше, чем концентрация фермента. Чтобы часть фермента осталась свободной – меньше ингибитора добавляем.

Если концентрация ингибитора не очень большая, но сравнима с концентрация фермента мы можем добиться полного ингибирования, но этот процесс потребует времени.

Должны помнить о том что в некоторых случаях ингибитор может связываться с несколькими точками (например, с SH-группами); для разных SH гр К связывания ингибитора с группой может быть разная, и тогда мы получим другой характер кривой. Возможно, даже с изломами характеризующими исчерпание быстро реагирующих групп. SH групп в белке как правило очень много, когда мы то с каким-то реагентов проводим реакцию….

Меняются характеристики (спектральные) ингибитора и фермента.

Не ртуть в орг соед парахлор…бензоат, хлор уходит – более прочное связывание, кольцо меняет поглощение. Не однофазная кривая.

В ферменте имеются 1-2 гр более активные, чем остальные, как правило это в АЦ. Часто уже депротонированные оказываются. В той же временной шкале изменяется активность фермента. Модификация сульфидных групп продолжается, а активности уже практически нет. Эта часть связана с группами фермента в АЦ.

Важно то что такие необратим идентификаторы позволяют идентифицировать те аминокислоты, которые входят в АЦ в смысле пространственного положения белка, т.е., получив такую модификацию, мы дальше что можем сделать:

Мы берем модифицированный белок и гидролиз протеазой – получаем набор пептидов. Берем немодифицированный белок и тоже протеазой, получаем набор таких же пептидов кроме одного. Т.е. если мы имели модифицированный и не модифицированный белок то эти белки будут идентичны. Дальше разделим их каким-то двухмерным способом и получаем картинку – пятна.

В медицинской практике тоже – влияние на преобразование сигнальных веществ. (к чему это?) он говорил про модификацию ферментов и типа часто в медицине применяется

8.12.15 Конкурентное и бесконкурентное ингибирование.

Бывают случаи, когда необратимым является ингибрование, не приводящее к ковалентным модификациям.

NB:

Ковалентная связь (от лат. co — «совместно» и vales — «имеющий силу») — химическая связь, образованная перекрытием (обобществлением) пары валентных электронных облаков. Обеспечивающие связь электронные облака (электроны) называются общей электронной парой. С учётом статистической интерпретации волновой функции М. Борна плотность вероятности нахождения связывающих электронов концентрируется в пространстве между ядрами молекулы. Характерные свойства ковалентной связи — направленность, насыщаемость, полярность, поляризуемость — определяют химические и физические свойства соединений.

Направленность связи обусловлена молекулярным строением вещества и геометрической формы их молекулы. Углы между двумя связями называют валентными.

Бывают такие соединения, которые связываются с ферментом настолько прочно, что фактически мы можем считать это необратимой реакцией. Наиболее интересный пример – токсин бледной поганки. Спасти нельзя, так как связывается необратимо. Нужно меньше мг вещества – около 150 г гриба. Уникальная специфичность: он связывается с РНК-pol II эукариотических организмов. Исключения – некоторые виды грибов, которые видимо эволюционно приспособились, так как сами образуют токсины. Но не только они: некоторые дрожжи менее чувствительны. Из 3-х форм только с II и с определенной (2-ой) субъединицей, которая имеет практически постоянную массу 140 тыс Да довольно близка по последовательности у многих организмов. Связывание настолько прочно, что удалить не удается даже при денатурационных процессах, скажем, умеренными концентрациями SDS. Можно этот токсин использовать, как метку на этот полипептид (белок).

Хотя токсин ковалентно и не связывается, по-видимому, там такое количество очень точных нековалентных взаимодействий, что разрушить их практически невозможно. В некоторых случаях такими ингибиторами являются белки. В качестве метки использовать их неудобно из-за больших размеров. Но для ингибирования пригодны. Здесь имеет место прочное взаимодействие, поскольку большие молекулы многими своими центрами связываются между собой.

Другая группа ингибиторов не образует таких прочных комплексов, т.е. связывание обратимо, и в этом случае мы имеем дело с неким равновесием. Т.е. ингибитор как таковой может присоединиться и отсоединиться от фермента спокойно, это происходит так же как и присоед/отсоед от субстрата, и это описывается определенными уравнениями. Связывание ингибитора может идти по разным участкам фермента. Это приводит к разным механизмам ингибирования.

Конкурентное ингибирование

Связываясь с ферментом, ингибитор может занять место в АЦ фермента, таким образом, что S будет не в состоянии связаться. В то же время, если S будет связываться, то он будет мешать ингибитору это делать. Т.е. мы наблюдаем конкуренцию между S и ингибитором за связь с ферментом в АЦ. Ингибитор связывается именно с теми группами, которые ответственны за связывание.

Будет несколько меньше свободного фермента, поскольку часть его будет связываться с ингибитором.

Имеют место константы: К ингибирования - стандартная К равновесия реакции:

(1) Ki= E*I/EI = k+i/k-I (если по картинке выше: Кинг=E*I/EI=k3/k-3)

Обязаны учитывать убыль фермента в этот комплекс и, как следствие, количество свободного фермента будет ниже.

Суммарная концентрация фермента:

(2) Е0=Е+EI+ES

Концентрацию комплекса фермент+ингибитор выражаем из К ингибрования:

(3) [EI]=[E]*[I]/Ki

и подставляем в уравнение (2).

Поскольку есть здесь эта (Е) величина – вынесем и получим (4)[Е0] = [Е]*(1+[I]/Ki)+ [ES]

Выразим конц ФСК:

(5) [ES] = [Е0] – [E]*(1+[I]/Ki)

Если мы будем дальше выражать скорость реакции, получим: V=k+2 *[ES]

Дальше будет уравнение, где Км будет умножена на некий доп член : V=Vmax*[S]/Km(1+[I]/Ki)+[S]

В знаменателе выражение для скорости будет больше на этот доп член, и скорость будет всегда тем меньше, чем больше концентрация ингибитора.

Исходя из кинетических экспериментов, можем определить константу, которая выражает сродство ингибитора к субстрату.

Если мы вернемся к качественному анализу уравнения Михаэлиса, то можно сказать, что при больших концентрациях S выражение (1+…) становится незначимым (∞малым), им можно пренебречь. Ранее было сказано, что когда [S] становится >> Км, то скорость приближается к Vmax. Это означает, что при любой концентрации ингибитора теоретически есть такая концентрация субстрата, при которой скорость все равно будет достигать максимальных значений.

НЕТ ВРЕМЕНИ ОБЪЯСНЯТЬ КАК ЭТО ВЫВОДИЛИ

При некой постоянной концентрации ингибитора будем иметь некую стандартную кривую зависимости скорости от концентрации. Удобнее работать с линейными формами.

Используем форму Лайнуивера-Берка, т.е. обратные величины 1/v 1/S, с той разницей, что Км будет домножена на (1+…)=Kм’. ПРЯМАЯ! v и S никак не меняются.

Есть некая концентрация без ингибитора, при наличии ингибитора скорости будут ниже при тех же концентрациях субстрата, значит полученная прямая пойдет выше. Кривая будет поднимать выше и выше и величина Км будет все меньше и меньше. Во всех случаях мы достигаем максимальной [S] и мы получаем одну и ту же максимальную скорость. (точка 1/Vmax пересечения линий на игреке)

Кажущаяся Kм’= Км + (Км/Кi)*I

Зависимость этой величины от концентрации ингибитора будет линейна