Материал: Konspekty_Enzimologiya

Величина –Ki равна по модулю Кi. Мы получаем характеристику, которая описывает связывание ингибитора с ферментом. Эта величина - константа, т.е. она характеризует данный ингибитор и данное взаимодействие.

Очень часто в околобиологических исследованиях используют такую величину в качестве концентрации полуингибирования. У медиков это модно - величина, приводящая к половинному эффекту.

В случае конкурентного ингибирования эта величина бессмысленна, потому что она будет зависеть от концентрации S. Мы можем дать некую концентрацию ингибитора и получить 50% ингибирования, потом увеличить концентрацию S и, как следствие, в этом уравнении изменится и скорость. Т.е. чем больше S при данной концентрации ингибитора, тем выше скорость. Таким образом, характеристикой может быть именно величина Кi, которая является Кд комплекса фермент+ингибитор.

Конкурентные ингибиторы имеют важное значение в исследованиях АЦ ферментов, потому что для того, чтобы быть конкурентным ингибитором, надо связаться там же, где и S. Имея большой спектр ингибиторов, различающихся отдельными структурными группами, можно определить значимость той или иной группы для связывания с ферментом, то есть предсказать, с чем на ферменте субстрат будет связываться. Это сложная работа!

Если известно, что вещество с известной структурой является ингибитором, мы можем заменять в нем те или иные группы, получать производные и смотреть, как меняется Ki. В тех случаях, когда изменение в составе молекулы ингибитора за счет удаления или изменения какой-то группы незначительно, значит, в связывании эта группа не участвует. Если же они резко изменяют константу, значит эти группы непосредственно участвуют в связывании.

Имеет место еще и конформация ингибитора. В некоторых случаях она может меняться при связывании, поэтому не всегда так просто трактовать результаты. Работа

такого рода обычно не проводится на ферменте (только для тех, где все равно надо получить ингибитор в конечном счете, например, для медицинских целей. Многие медицинские лекарства – конкурентные (в основном) ингибиторы.)

Данный вид ингибирования встречается довольно часто и в реальной жизни клетки.

Есть фермент глутаминсинтетаза – с него начинается синтез органического азота. Фермент берет ион NH4+ и включает в органические соединения: из Glu – Gln с затратой АТФ.

Его активность должна обеспечивать достаточное количество аминных групп для синтеза у организмов, которые умеют делать эти соединения - Е.coli и дрожжи. Активность фермента очень важна, но избыточная активность клетке не нужна. Клетке нужно включить столько азота в органику, сколько у нее потребности в аминокислотах и нуклеотидах для роста. Поэтому существует много веществ, которые регулируют активность этого фермента, связываясь с теми или иными его участками. Необычный эффект конкурентного ингибирования глюкозамином – конкурирование с ионом аммония. Большая органическая молекула конкурирует с маленьким неорганическим ионом, но именно этого оказывается достаточно, чтобы скоординировать количество образования органического азота с потребностями в аминосахарах. Если их много – снижается образование.

В том центре, где связывается S, ингибиторы могут связываться и в других участках, причем это может быть связывание, которое сказывается на АЦ непосредственно, т.е. он связывается на нем, но не в том месте, где S, а в соседнем участке. Блокируется важная для катализа группа. Либо это может быть связывание с отдаленным участком, которое приводит к изменению конформации АЦ, группы смещаются и катализ тоже не происходит.

Фермент может свободно связывать S, но не может его превращать – неконкуретное ингибирование.

Появляется дополнительная возможность в уравнении:

Т.о., появляется возможность удаления фермента из реакционной смеси, но в отличие от конкурентного ингибирования, S на связывание I в данном случае не влияет. Т.е. при любой концентрации субстрата ингибитор связывается независимо, и вместе с тем при любой концентрации ингибитора субстрат будет связываться. Связываясь при высоких концентрациях ингибитора, он попадет в комплекс и не будет превращаться. Т.е. часть ФСК будет непродуктивной. Это приведет к тому что в нашем уравнении мы

ФСК заменим на часть его - эквивалентно тому, что уменьшится концентрация активного фермента. Концентрация активного фермента может быть отнесена к нулевой концентрации фермента. Просто фермента в системе стало меньше.

Значит, в выражении максимальной скорости:

Vmax=k+2*E0 общая концентрация снижается => Vmax тоже снижается

Выводить не будем, но она снизится ровно так же, как повышалась Км в конкурентном ингибировании:

Vmax ‘ = Vmax/(1+I/Ki)

Дальше - опять будет уравнение Михаэлиса-Ментена, только с этой величиной в числителе:

V= Vmax ‘ *S/(Km+S) Км не изменяется.

Все прямые на графике проходят через одну точку на оси X = (-1/Км), по Y точки – 1/vmax’.

Эти точки – кажущиеся максимальные скорости. Можем построить вторичные графики 1/ vmax’ от конц I:

На игреке – 1/Vmах, на иксе –Ki Если I=K: : V’max=Vmax/2.

Когда ингибирование неконкурентое, можем использовать величину полуингибирования как характеристику.

Но эти графики не всегда реализуются.

Бывает, что ФИК способен превращаться в продукт с некой k+3, тогда появляются дополнительные члены в уравнении, это усложняет общую картину, понятие кажущейся скорости включает два члена (еще уравнение, характеризующее этот процесс).

При анализе неполного неконкурентного ингибирования – изменение положения точки ниже оси.

Точка будет также соответствовать субстратной К связывания фермента с S, т.е. включит К образования комплекса. А эта часть предшествует превращению, т.е. она играет роль предварительной стадии, которая описывается через К образ комплекса. При этом все остальное - примерно также, и Vmax можно рассчитать, но нужды в этом нет, важнее константа.

Если есть точка пересечения и она находится в том месте – есть неполное ингибирование, его характеристикой будет 1/Ks.

Км не описывает сродство фермента к субстрату! Она включает не только Кд, но и К превращения ФСК в фермент и продукт, и эта дополнительная величина может настолько сильно изменить уравнение, что уже не будет иметь отношения к сродству. Поэтому такой подход может определить истинную Кs.

Мы рассмотрели 2 случая ингибирования. Но их гораздо больше. Все они приводят к несколько разным эффектам. Эти – все предсказуемо в целом. Но часто возникает ситуация, когда ингибитор, связываясь с S, влияет как на связывание с субстратом, так и на его превращение.

Возникают 2 разных ситуации:

1)Смешанное ингибирование. Ухудшаются и связывание, и катализ, потому что ингибитор мешает ферменту принять нужную конформацию и подсоединиться к S. Это не очень однозначно описывается кинетически. Важно качественное явление - в этом случае кривые в обратных координатах, построенные для разных концентраций ингибитора, не будут иметь единой точки пересечения.