Материал: Konspekty_Enzimologiya
Впрактике обычно используют:
●единицы количества вещества – моль (и его производные ммоль, мкмоль), грамм (кг, мг),
●единицы времени – минута, час, секунда,
●единицы массы или объема – грамм (кг, мг), литр (мл).
Активно используются и другие производные – катал (моль/с), международная единица активности (МЕ, Unit) соответствует мкмоль/мин.
Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с*л, г/час*л, МЕ/л, кат/мл и т.д.
Причины плато:
- с течением времени может снижаться активность
фермента - субстрат кончается
(наступает равновесие)
Скорость превращения измеряют либо по убыли субстрата, либо по прибыли продукта.
Активность фермента меряется на линейном участке кривой активности (при времени, близком к 0) - там будут истинные значения скорости.
При измерении активности часто можно получить неканоничные графики.
Причины формы кривой (1), когда нет линейного участка:
● недостаточно субстрата ● нереакционноспособность фермента
в этих условиях:
-
слишком холодно
-
неоптимальный рН
- (ин)активация вещ-ва
●слишком сильное разведение фермента, он денатурирует (можно добавить балластные белки (альбумин, лактальбумин и т.п.) или вещества, связывающие свободную воду (глицерин и т.п.)). В растворе глицерина (30%) при заморозке происходит стеклование (витрификация) вместо кристаллизации.
●фермент нестабилен
Причины формы кривой (2), когда линейный участок-то есть, но померить не можем:
●слишком малое разведение фермента (высокая активность фермента => необходимо понизить концентрацию [E] )
Тут (куда указывает стрелочка на рисунке) линейный участок, но вообще кривая ненормальная. В начале могло быть:
● активность фермента могла быть подавлена, например произошла
агрегация фермента ● в ферменте нет нужного кофактора
(например, иона металла типа Zn2+ в алкогольДГ, для амилазы - Са2+), а когда мы прилили раствор субстрата и кофактора, фермент это кофактор связал.
Чтобы от этого избавиться:
- фермент разводят до добавления в реакционную смесь и инкубируют в той температуре, в которой
изменяется активность - чтобы он диссоциировал заранее
-проводят преинкубацию с нужными ионами или кофакторами
Внекоторых реакциях невозможно привести график к нормальному, тогда считают как есть, с ошибкой.
При измерении активности фермента с одной стороны стоят точность, а с другой - время и сложность доставания реактивов.
Минимально нужно замерить 4-5 точек на графике (из которых 2-3 гарантированно должны принадлежать линейному участку).
Для нормальной работы фермента нужны:
1)оптимальный рН - буферный раствор. Надо стараться, чтобы буфер не влиял на саму реакцию; быть осторожней с разведением буфера. От рН зависят и активность, и стабильность фермента. Для большей части ферментов верна
такая зависимость (колокол рН):
На рисунке у стрелочки надпись: “оптимальное соотношение протонированных и депротонированных групп в ферменте”.
Перегибы указывают на рН, соответствующие константам диссоциации аминокислот в активном центре.
рН-оптимум фермента м.б. не точкой, а плато, и находиться где угодно, но чаще всего - в слабокислой области рН (6-7). У пепсина левее оптимума (около 2 рН) идет сразу денатурация (см. график ниже).
Но! рН может меняться при взаимодействии компонентов (сдвиг происходит): поглощение/выделение протона в процессе реакции (такое происходит при гидролизе АТФ), в т.ч. образование плато => нужен буфер для поддержания постоянного рН. Условие буферного раствора - должен не взаимодействовать с ферментом, субстратом, кофакторами.
-Фосфатный буфер связывает ионы, кроме того может регулировать работу фермента. Некоторые ферменты используют фосфат в качестве субстрата. Вообще фосфатанион, от которого так или иначе зависят очень многие ферменты.
-Ацетатный буфер также может влиять на активность фермента как регулятор.
-Цитратный буфер связывает важные для катализа ионы (сильный комплексообразователь).
-Аммониевый буфер обладает малой ёмкостью.
-Трис зависит от разведения. Оптимум рН слабощелочной (6-8).
Совокупность всех буферов позволяет перекрыть весь диапазон требуемых рН. Но не все просты в употреблении, чаще используем концентрат буфера, который потом разводим, а рН меняется, как у Триса, например, на 0,5-1.
N.B.: 20 буферов Гуда перекрывают от 6,15 до 8,55.
Буферы лучше хранить концентрированными и при невысоких температурах, некоторые лучше в темноте.
2) оптимальная температура
У стрелочки на рисунке надпись “из-за денатурации белка”.
Бывают ферменты, оптимум которых 15-20 градусов и даже 12 (чаще около 40-60 градусов в среднем).
Чтобы охарактеризовать фермент, его активность меряют не при его температурном оптимуме,т.к. в этой области маленькое to вызовет большую ошибку в Е, а при низких to (принято при 30оС, исключения - ферменты термофильных организмов и нетермостабильные ферменты). Исходно мерили при 25 градусах, но из-за Индии, Бразилии и т.д. проще стало всем мерить при 30 градусах.
N.B.: Термофильные ферменты используют в ПЦР и добавляют в стиральный порошок - там они гидролизуют жиры. Иногда приходится мерить при пониженных температурах из-за неустойчивых промежуточных комплексов (20-25 градусов). Чтобы не было скачка температур, лучше добавлять минимальный объём концентрированного раствора фермента.
3)кофакторы (например, ионы Mе2+ и Mе3+) - входят в состав АЦ или обеспечивают правильную конформацию белка. Легко диссоциируют в ряде случаев
●Mg2+: входит в активный центр DNA-pol и необходим для всех ферментов, использующих субстраты в виде магниевых солей (например, нуклеотиды).
●Zn2+: в алкогольдегидрогеназе, карбоангидразе. Координирует воду в активном центре так, что она легко атакует субстрат. Работает как кислота Льюиса, стабилизируя неподеленные электронные пары нуклеофилов.
●Fe2+, Cu2+ - переносят электроны в клетке, так как способны менять
степень окисления.
●Mn2+- тоже участвует в ОВР, часто может заменять магний, если марганец в форме Mn2+
●Ca2+ - важен для немногих ферментов, так как его концентрация в цитоплазме очень мала, он же сигнальный..
●Mo, V в нитрогеназе, нитратредуктазе и у метаногенов. А еще молибдоптерины, которые кофакторы в разных интересных процессах.
4)наличие или отсутствие S-S мостиков (чаще всего они мешают реакции и их надо восстанавливать). Раньше для восстановления S-S мостиков пользовались свободным цистеином (получали из волос цистин >10%), но его надо много по массе. Поэтому стали использовать синтетический аналог цистеина - 2-меркаптоэтанол. “Воняет ужасно”, 5-10мМ, летучий, оказывает нервно-паралитическое действие.
Потом для этой цели стали использовать димер меркаптоэтанола - дитиотреитол (DTT): менее пахуч и летуч, более устойчив в растворах и энтропийный фактор
благоприятствует его восстановительной способности. Когда DTT присоединяется к одному из атомов S в белке, оставшиеся стадии протекают с легкостью, потому что реакция высвобождения окисленного DTTмономолекулярная, то есть для ее протекания одной молекуле не надо искать другую в растворе, а достаточно лишь замкнуться в цикл. Кроме того, в начале реакции у нас было две молекулы, а в концетри. Энтропия возросла. Норм?(можно объяснить, как именно, я не знаю) - мономолекулярная реакция всегда более вероятная типа было две молекулы, стало три, так? ну белок - это одна молекула, имхо суть в том, что больше вероятность того, что конец одной молекулы DТТ окажется близко к S-S мостику, на предпоследней стадииок, а теперь давайте это напишем!). Кроме того, в конце реакции образуется стабильный шестиатомный цикл.
Штука в конце - циклический или окисленный дитиотреитол. ДОЛЖНО БЫТЬ 4 атома углерода после присоединения ДТТ к мостику.
22.9.15 Измерение активности ферментов
Для измерения активности нужно:
●иметь линейный участок на кривой активности
●проводить реакцию при оптимальном рН
●30оС
Производные активности:
●удельная - отнесённая к мг белка. Увеличение удельной активности - основной критерий очистки фермента (обратная активность фермента в данном препарате)
●в пересчёте на активный центр фермента - отнесённая к числу оборотов фермента (числу молекул субстрата, превращаемых за одну минуту, на одну молекулу фермента; безразмерная величина - то, сколько раз 1 АЦ осуществляет реакцию в единицу времени)
Техника измерения активности фермента: