Материал: 4047

Цель работы: доказать каталитическое действие белков-ферментов, показать их высокую специфичность, а также наивысшую активность в физиологической среде.

Задание

Определить специфичность действия фермента амилазы.

Материальную основу всех процессов жизнедеятельности составляют тысячи химических реакций, скорость протекания которых зависит oт ряда факторов: природы реагирующих веществ, их концентрации, температуры, давления и т.д. Для организма человека вышеназванные факторы имеют небольшое значение, однако скорость протекания биохимических реакций чрезвычайно высока. Например, в лабораторных условиях гидролиз 1 г белка до составляющих его аминокислот протекает в течение 24 часов при температуре 100оС в присутствии соляной кислоты высокой концентрации. В пищеварительном тракте этот же процесс заканчивается через 2 часа при температуре 37оС и концентрации соляной кислоты в три раза ниже, чем вне организма. Объяснение этому – присутствие в клетке специфических катализаторов – ферментов.

Ферменты или энзимы - вещества белковой природы, образующиеся непосредственно в клетках и ускоряющие течение всех типов химических реакций живого организма.

Как и все белки, они имеют высокую молекулярную массу от 12 000 до 500 000 у.е., определенный уровень организации (чаще третичную структуру), подвергаются гидролизу и денатурации.

Синтезируются ферменты только в клетках различных тканей и работать могут как внутри, так и вне создавшей их клетки. Поэтому различают ферменты внутри- и внеклеточные.

Внутриклеточные ферменты содержатся и действуют в определенных органоидах. В настоящее время установлено, что ферменты гликолиза находятся в цитоплазме, ферменты цикла трикарбоновых кислот и -окисления жирных карбоновых кислот – в матриксе митохондрий, ферменты окислительного фосфорилирования

–на внутренней мембране митохондрий, ДHK – полимеразы – ядрах, гидролитические ферменты – в лизосомах и т.д. Клетки различных тканей и органов различаются не только по набору ферментов, но и по их активности. Например, ферменты гликолиза и креатинкиназа наиболее активны в скелетных мышцах, ферменты орнитинового цикла

–в клетках печени, глутаминаза – в клетках мозга.

Внеклеточные ферменты образуются в клетках, но действуют, как правило, внутри полых органов. Например, пищеварительные ферменты вырабатываются клетками стенок пищеварительного тракта, а работают в различных отделах пищеварительной системы. По строению ферменты делят на простые (протеины) и сложные

(протеиды). Молекулы простых ферментов построены только из аминокислот. К ним относятся все гидролитические ферменты (пепсин, трипсин, липаза, амилаза, мальтаза, сахараза и т.д.), уреаза. Молекулы сложных ферментов в своем составе имеют белковую часть, состоящую из аминокислот (апофермент), и небелковую часть

(кофермент). В составе последнего встречаются ионы металлов (Zn2+, Cu2+, Fe2+, Mo2+), витамины (РР, В1, В2, В3, В6, B12, Вс), ацетил-КоА и другие вещества (табл. 1). Апофермент и кофермент по отдельности

малоактивны, но при их соединении активность резко возрастает. Таблица 1.Важнейшие коферменты, в состав которых входят витамины

Специфичность ферментов подразделяют:

-на абсолютную, то есть способность катализировать одну единственную реакцию (например, уреаза ускоряет расщепление мочевины на аммиак и углекислый газ);

-относительную, позволяющую воздействовать на определенный тип химической связи (например, пепсин расщепляет амидные связи, липаза сложноэфирные связи).

Их высокая специфичность заключается в том, что каждый фермент может катализировать только одну или группу сходных реакций, действуя на одно вещество или на ряд близкородственных веществ. Так, амилаза слюны ускоряет гидролиз только полисахаридов и не оказывает действие на дисахариды.

Практическая часть

Ферментативный гидролиз крахмала. В качестве фермента, гидролизующего крахмал на его составные части (мальтозу, глюкозу), выступает амилаза слюны. Оценка результатов опытов проводится с помощью цветных реакций с иодом и реакции Троммера. Соответственно продукты гидролиза крахмала не дают реакции с иодом, но положительно реагируют на реактив Троммера.

В 2 пробирки налейте по 10 капель 1%-ного раствора крахмала. В пробирку №1 (контроль) внесите 4 капли воды, а в пробирку №2 – 4 капли раствора слюны, разведенной в 5 раз. Перемешайте и поставьте в термостат или водяную баню на 15 мин при 370С. Затем из пробирки возьмите 4 капли исследуемого вещества, которые внесите в 2 разные пробирки. В одну из них добавьте одну каплю 1%-ного раствора иода, а в другую – одну каплю 5%-ного раствора сульфата меди и 4 капли 10%-ного раствора гидроксида натрия, осторожно нагрейте до кипения (реакция Троммера). Аналогичную процедуру выполните с содержимым пробирки №2. Результат должен показать, что в присутствии воды гидролиза крахмала не происходит и реакция с иодом должна быть положительной, а реакция Троммера – отрицательной (гидрат окиси меди – голубой цвет), тогда как в присутствии амилазы слюны результаты должны быть противоположными, поскольку произошел гидролиз крахмала.

Нет реакции с иодом и произошло окрашивание в кирпичнокрасный цвет (закись меди) в реакции Троммера.

Специфичность действия ферментов.

Каждый фермент действует только на одно вещество или группу сходных субстратов, что обусловлено соответствием структуры фермента, точнее его активного центра и структуры субстрата. Например, амилаза действует только на крахмал, сахараза – только на сахарозу.

Приготовление сахарозы: палочку дрожжей (100г) разотрите и залейте водой (400мл). через 2час отфильтруйте и храните в холодильнике. В две пробирки (№1 и №2) внесите по 10 капель 1%- ного раствора крахмала, в две другие (№3 и №4) – по 10 капель 2%- ного раствора сахарозы. Затем в пробирки №1 и №3 добавьте по 4 капли раствора слюны, разведенного в 5 раз, а в пробирки №2 и №4 – такое же количество раствора сахарозы. Перемешайте и оставьте в термостате на 15 мин при 370с. После этого с содержимым всех четырех пробирок осуществите реакции с иодом и Троммера. Результаты занесите в таблицу.

В выводах следует отметить, в какой пробирке и при каких условиях обнаружено действие фермента и почему.

Влияние рН среды на активность фермента.

Для каждого фермента существует определенное значение реакции среды, при котором он проявляет наивысшую активность. Изменение рН вызывает снижение или полное торможение деятельности фермента.

В 8 пробирок прилейте по 1 мл дистиллированной воды, а затем в пробирку №1 внесите 1 мл 0,2%-ного раствора соляной кислоты, перемешайте, отберите из нее 1 мл смеси и перенесите в пробирку №2. Перемешайте, отлейте 1 мл и перенесите в пробирку №3 и т.д. из пробирки №8 отберите 1 мл и вылейте, таким образом получите различные рН среды. После этого в каждую пробирку добавьте по 2 мл 1%-ного раствора крахмала и по 1 мл раствора слюны, разведенного

1:10. Пробирки встряхните и поставьте в термостат на 15 мин при 370С. Затем охладите и добавьте во все пробирки по 1 капле 1%-ного раствора иода.

Полный гидролиз крахмала произойдет в пробирках №5 и №6, где рН среды раствора находится в пределах 6,8-7,2, т.е. оптимальных для действия амилазы.

Вопросы для самопроверки

1.Что такое ферменты, их химическая природа?

2.Какие отличия есть в составе молекулы простых и сложных ферментов?

3.Что такое активный центр фермента?

4.Механизм действия ферментов.

5.Дайте определение понятий: энергетический барьер реакции, энергия активации.

6. Свойства ферментов как биологических катализаторов.

В чем состоит специфичность действия ферментов? Приведите примеры.

7. Какие процессы в организме катализируют ферменты гидролазы? Приведите примеры.

Лабораторная работа №6

Приготовление питательных сред для микроорганизмов, способы их стерилизации. Автоклавирование

Цель работы: ознакомиться с методами дезинфекции и стерилизации.

Задание

1.Ознакомиться с основными методами дезинфекции и дезинфицирующими веществами.

2.Ознакомиться с основными методами стерилизации.

3.Подготовить к стерилизации лабораторную посуду: чашки Петри, пробирки и пипетки.

4.Провести стерилизацию лабораторной посуды.

Питательные среды (ПС) должны отвечать следующим минимальным требованиям: в них должны присутствовать все элементы, из которых строится клетка в такой форме, в которой микроорганизмы способны их усваивать. По количественному вкладу в построении клетки различают микро- и макроэлементы. К

макроэлементам относят: C, N, H, O, S, Ca, K, Fe, P, Mg. К

микроэлементам относят: Mn, Zn, Mo, Cu, Co и др. Они содержатся в основном в качестве примесей в солях микроэлементов, а также попадают в ПС из стекла лабораторной посуды, с пылью и водопроводной водой. Также многие микроорганизмы нуждаются в факторах роста. Эти вещества входят в основной состав клетки, но некоторые организмы не способны их синтезировать сами.

В микробиологической практике для выращивания микроорганизмов используют разнообразные питательные среды, которые по составу подразделяют на естественные или натуральные, полусинтетические и синтетические среды.

Натуральные среды состоят из продуктов животного и растительного происхождения. К таким средам относятся овощные или фруктовые соки, кровь, молоко, вода, отвары, полученные из природных субстратов, как, например, мясо, навоз, почва и др. На таких средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как они содержат все компоненты, необходимые для их роста и развития. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный состав и малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, так как не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды и образования продуктов обмена по ходу развития. Натуральные среды используют для поддержания культур микроорганизмов и накопления их биомассы. Примерами натуральных сред являются: мясо-пептонный бульон (МПБ), гидролизат рыбной муки (ГРМ), бульон Хоттингера, пивное, солодовое, виноградное, яблочное, мелассное сусло, дрожжевая, картофельная, капустная среды, почва и др. При добавлении агара в ГРМ получают ГРМ-агар, в МПБ - МПА.

Полусинтетические среды в своѐм составе наряду с соединениями известной химической природы содержат вещества неопределенного состава. К полусинтетическим средам относят МПБ с