Материал: 4047

Промытый препарат просушивают на воздухе. Для более быстрого высыхания нижнюю часть стекла и края, на которых нет препарата, можно промокнуть фильтровальной бумагой.

Окраска спор бактерий.

Для окраски спор готовят мазок бактерий так, как описано выше, но не фиксируют его. На сухой мазок наносят 1–2 капли 0,5%-ного раствора соляной кислоты и нагревают его в течение 1–2 мин над пламенем спиртовки(до выделения паров). Остатки кислоты сливают, мазок промывают водой, высушивают на воздухе и фиксируют в пламени спиртовки. На охлажденный фиксированный мазок наносят1– 2 капли фуксина Циля и нагревают над пламенем спиртовки до появления пара. При этом необходимо следить, чтобы раствор краски не подсох. Краситель смывают водой и погружают препарат в стаканчик с 5%-ным раствором серной кислоты на 20–40 с, после чего его сразу же промывают водой. При погружении в кислоту протоплазма клеток обесцвечивается, а споры остаются окрашенными. На промытый препарат наносят на 3–5 мин метиленовую синь Лефлера(2–3 капли), после чего препарат тщательно промывают водой и высушивают. При этом способе окраски споры окрашиваются в красный цвет, а клетки– в голубой.

Окрасить бактерии по методу Грама.

Сущность метода заключается в том, что бактерии последовательно Окрашиваются красителем генцианвиолетом и йодом, а затем

обрабатываются спиртом. При этом одни бактерии – грамположительные – остаются окрашенными, а другие – грамотрицательные – обесцвечиваются. Это связано с тем, что у грамположительных бактерий образовавшееся окрашенное соединение при обработке спиртом удерживается в протоплазме клетки, а у грамотрицательных оно вымывается из клетки. Приготовить мазок так, как указано выше. На фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, наносят на нее в том месте, под которым находится мазок, 3–4 капли раствора генцианвиолета, и при помощи пинцета разглаживая бумагу, плотно прижимают к стеклу. Через 2 мин бумагу снимают, а излишки краски смывают водой. На мазок наносят3–4 капли раствора Люголя(раствор йода в йодистом калии) и по истечении 2 мин сливают его. Препарат погружают в стаканчик с 96%-ным спиртом на30–40 с и сразу же после этого промывают водой. На препарат наносят на 2 мин разбавленный раствор фуксина. После этого промывают его водой и просушивают. При данном способе окраски грамположительные бактерии будут фиолетовыми, а грамотрицательные – красными, так как после обесцвечивания спиртом они окрашиваются фуксином.

Внимание!

При недостаточной обработке мазка спиртом все клетки сохраняют свою окраску, а при избыточной все обесцвечиваются.

Микроскопировать окрашенные препараты.

Все окрашенные препараты последовательно микроскопируют сначала с объективом 8х или 10х, а затем наносят на них каплю иммерсионного масла и микроскопируют с объективом 90х или 100х. Увиденное в микроскоп при большом увеличении(объектив 90х или 100х) зарисовывают в тетради. Делают выводы о наличии у разных микроорганизмов спор и об их отношении к окраске поГраму.

Вопросы для самоконтроля

1.Что входит в состав частей микроскопа: механической; оптической; осветительной?

2.Какие объективы называются сухими?

3.Какие объективы называются иммерсионными?

4.Для чего при микроскопировании на больших увеличениях фронтальную линзу объектива помещают в каплю иммерсионного масла?

5.Каковы правила работы с конденсором?

6.Каковы правила работы с макро- и микровинтами?

7.Как определить увеличение:

–монокулярного микроскопа;

–бинокулярного микроскопа?

8. Как приготовить препарат типа «раздавленная капля» и в каких случаях применяют эти препараты?

9. Как приготовить препарат типа «висячаякапля» и в каких случаях применяют эти препараты?

10. Как приготовить мазок?

11. Для чего проводят фиксацию мазка?

12. Какие методы окраски называются простыми, а какие – сложными? 13. Каким образом проводят окраску микроорганизмов простым способом?

14. На чем основана окраска спор бактерий и как ее проводят? 15. На чем основана окраска бактерий по методу Грама и как ее проводят?

16. Какой цвет имеют грамположительные и грамотрицательные бактерии?

Лабораторная работа №2

Обнаружение биологических молекул в субстратах качественными реакциями

Цель: приобрести навыки в определении функциональных групп биологических молекул в различных субстратах.

Задание

1.Провести реакцию на спиртовую группу (в составе глицерина).

2.Провести реакцию на альдегидную группу (в составе глюкозы).

3.Провести реакцию на карбоксильную группу (в составе щавелевой кислоты).

4.Провести реакцию на аминогруппу (в составе глицина). 5.Провести реакцию на карбонильную группу (в составе ацетона).

Практическая часть

1. Реакция на спиртовую группу (в составе глицерина)

Глицерин является трехатомным спиртом, т.е. содержит в своем составе три гидроксильных группы (-ОН). Образует при взаимодействии с гидроксидом меди соединение темно – синего цвета

– глицерат меди.

Порядок выполнения работы.

К 1 мл 1% раствора глицерина добавить 10 капель 10% раствора гидроксида натрия и 4 капли 1% раствора сернокислой меди. Появляется темно – синее окрашивание, обусловленное образованием глицерата меди. Записать уравнение реакции.

2. Реакция на альдегидную группу (в составе глюкозы)

Альдегиды легко окисляются оксидами и гидроксидами тяжелых металлов, превращаясь в кислоты (например, глюкоза окисляется до глюконовой кислоты). Окислитель при этом восстанавливается до закиси или до свободного металла.

Порядок выполнения работы.

Налить в пробирку 0,5 мл 10% раствора глюкозы и 0,5 мл 10% раствора едкого натра, затем добавить 2-3 капли 1% раствора сернокислой меди до образования легкой не исчезающей мути. Содержимое пробирки встряхнуть и нагреть на пламени спиртовки в верхней части раствора. Появление желтого окрашивания, переходящего в красное, свидетельствует об образовании оксида меди

(I).Записать уравнение реакции.

3. Реакция на карбоксильную группу (в составе щавелевой кислоты)

Функциональной группой всех органических кислот является карбоксильная (-СООН). Органические кислоты способны подобно неорганическим взаимодействовать с солями.

Порядок выполнения работы.

В пробирку налить 1 мл 1% раствора щавелевой кислоты, добавить 5-6 капель 2% раствора хлористого кальция. Выпадает осадок щавелевокислого кальция. Записать уравнение реакции.

4. Реакция на аминогруппу (в составе глицина)

Растворы аминокислот при нагревании с нингидрином дают синее или фиолетовое окрашивание. Реакция обусловлена наличием аминогруппы (-NH2 ) в α- положении.

Порядок выполнения работы.

В пробирку наливают 5-6 капель 1% раствора аминокислоты глицин, прибавляют 2 капли 1% раствора нингидрина и нагревают на пламени спиртовки. Появляется сине-фиолетовое окрашивание. Записать результаты опыта.

5. Реакция на карбонильную группу (в составе ацетона)

Ацетон с нитропруссидом натрия дает оранжево – красное окрашивание.

Порядок выполнения работы.

В пробирку поместить 0,3 мл ацетона, 0,3 мл 10% раствора едкого натра и 0,3 мл свежеприготовленного 10% раствора нитропруссида натрия. Развивается оранжево – красное окрашивание. Записать результат опыта. Результаты опытов оформить в виде таблицы.

Вопросы для самоконтроля

Лабораторная работа №3

Определение активности действия ферментов у прокариотических клеток

Цель: Выяснить роль ферментов в клетках прокариот. Сравнить активность фермента в зависимости от условий окружающей среды.

Задание

1.Определить подъемную силу дрожжей ускоренным методом;

2.Определить кислотность дрожжей;

3.Определить фермент инвертазу в биомассе дрожжей.

Материал для исследования: биомасса брикетированных дрожжей различного срока хранения (свежие, 10-12 дней, свыше 12 дней хранения), сухие дрожжи и раствор фермента. Раствор фермента готовится перед занятием. Для этого сухие дрожжи растирают в ступке с трехкратным количеством кварцевого песка, прибавляют десятикратное количество воды и оставляют при 35ºС. После этого смесь фильтруют через бумажный фильтр. Прозрачный фильтрат употребляют в качестве раствора сахаразы.

Образ жизни прокариот состоит в постоянном воспроизводстве своей биомассы. Совокупность протекающих в клетке процессов, обеспечивающих воспроизводство биомассы, называется обменом веществ, или метаболизмом. Клеточный метаболизм складывается из двух потоков реакций, имеющих разную направленность: энергетического и конструктивного метаболизма. Энергетический метаболизм – это поток реакций, сопровождающихся мобилизацией энергии и преобразованием ее в электрохимическую или химическую (АТФ) форму, которая затем может использоваться во всех энергозависимых процессах. Конструктивный метаболизм (биосинтезы) – поток реакций, в результате которых за счет поступающих извне веществ строится вещество клеток; это процесс, связанный с потреблением свободной энергии, запасенной в химической форме в молекулах АТФ или других богатых энергией соединений.

Метаболические пути конструктивной и энергетической направленности состоят из множества последовательных ферментативных реакций и могут быть разделены на три этапа. На начальном — воздействию подвергаются молекулы, служащие исходными субстратами. Иногда эту часть метаболического пути называют периферическим метаболизмом, а ферменты,

катализирующие первые этапы превращения субстрата, — периферическими. Последующие превращения включают ряд ферментативных реакций и приводят к образованию промежуточных продуктов, или метаболитов, а сама цепь превращений объединяется под названием промежуточного метаболизма. Образующиеся на последних этапах конечные продукты конструктивных путей используются для построения вещества клеток, а энергетических — выделяются в окружающую среду.