Материал: 4047

Рисунок 4 – Схема приготовления разведений и посева суспензии микроорганизмов

В чашку Петри с подсушенной средой вносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают от двух до четырех параллельных высевов. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель.

После посева чашки Петри помещают в термостат крышками

вниз.

При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1; 0,5 или 1,0 мл) исходной суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 45…50 ºС среду, тщательно перемешивают, затем немедленно выливают в чашку Петри и дают среде застыть. В случае глубинного посева пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующим образом. По 1 мл из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2…4 стерильные чашки Петри. Затем заливают в чашки по 15…20 мл среды, расплавленной и остуженной до 45…50 ºС, и смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. Когда среда застынет, чашки Петри в перевернутом виде помещают в термостат.

Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри после посева помещают в анаэростат. Иногда для определения численности анаэробов плотную среду после засева оставляют в пробирках. Поверхность застывшей среды заливают

парафином. Для лучшего учета колоний микроорганизмов среды в этом случае рекомендуется осветлять.

Подсчет выросших колоний

Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 1…15 суток инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую просчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитывают колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иногда для подсчета колоний используют специальные полуавтоматические счетчики.

Лучшим разведением следует считать то, из которого при высеве в чашке Петри вырастает от 30 до 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из разведения на одной чашке.

Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:

где М – количество клеток в 1 мл; а – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;

V – объем суспензии, взятый для посева, мл; 10 – коэффициент разведения;

n – порядковый номер разведения, из которого сделан высев.

Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)

Метод используют для подсчета микроорганизмов, которые плохо или совсем не растут на плотных питательных средах. В пробирки с жидкой средой вносят строго измеренный объем из различных разведений питательного субстрата. После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых наблюдался или отсутствовал рост, рассчитывают наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 мл исследуемого субстрата. Таким образом, определение количества микроорганизмов методом предельных разведений включает приготовление разведений, посев в жидкую среду, регистрацию наличия или отсутствия роста после инкубации и расчет наиболее вероятного числа клеток в единице объема исходного субстрата.

Вопросы для самоконтроля

1. Какие счетные камеры вам известны?

2.Что из себя представляет счетная камера Горяева?

3.Из каких этапов складывается процесс изготовления исследуемого препарата для проведения количественного учета с помощью счетных камер?

4.Каковы размеры бактериальных клеток?

5.Способы измерения микроорганизмов.

6.Как определить цену окуляр-микрометра?

Литература

1.Белясова, Н.А. Микробиология [Электронный ресурс]: утв. Министерством образования республики Беларусь в качестве учебника

/Н.А. Белясова. – Минск: Выш. шк., 2012. – 443 с. - ЭБС "Знаниум".

2.Мамонтов С. Г. Биология [Текст] : доп. М-вом образования и науки Рос. Федерации в качестве учеб. для студентов высш. учеб. заведений / С. Г. Мамонтов, В. Б. Захаров, Т. А. Козлова; под ред. С. Г. Мамонтова. - 3-е изд., стер. - М.: Академия, 2008. - 576 с.

3.Сидоренко О. Д. Микробиология [Электронная версия]: доп. Министерством сельского хозяйства РФ в качестве учебника / О.Д. Сидоренко, Е.Г. Борисенко, А.А. Ванькова, Л.И. Войно. — М. : ИНФРА-М, 2017. — 286 с. - ЭБС "Знаниум".