Материал: 4047
линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микробов. Выделение чистой культуры методом рассева в глубине и на поверхности питательной среды основано на механическом разъединении и уменьшении микроорганизмов, с целью получения изолированных колоний при их росте на плотной питательной среде. Количество микроорганизмов, содержащихся в исследуемом материале, предугадать заранее трудно, поэтому для посева пользуются не одной, а двумя или тремя чашками Петри.
Описание полученных посевов микроорганизмов.
Характер роста колоний изучают при помощи лупы или при малом увеличении микроскопа. Для микроскопирования колоний чашку Петри с агаровой культурой помещают дном вверх на предметный столик микроскопа, рассматривают и делают описание колоний.
Рост микроорганизмов на МПБ.
При описании роста микробов на МПБ указывают:
–на характер помутнения;
–образование пленки на поверхности среды(тонкая, толстая, морщинистая, складчатая, слизистая ит. д.);
–количество, характер и цвет осадка(точечный, обильный, зернистый, слизистый, хлопьевидный, серый, беловато-желтый ит. д.);
–наличие пристеночного кольца и его характер: узкое, широкое, тонкое, узловатое, серое, синеватое и т. д.
Для анаэробов отмечают еще и наличие газообразования.
Рост на плотных средах.
Рост на плотных средах может быть сплошным или в виде отдельных колоний, обильным, слабым или умеренным. При описании роста колоний обращают внимание на следующие факторы:
–форму (круглая, овальная, неправильная, звездчатая и др.);
–размер (мельчайшие или росинчатые, мелкие, точечные, крупноточечные). Более крупные колонии измеряют по их диаметру(2–
3–5 мм);
–поверхность (плоская, выпуклая, блюдцеобразная, с приподнятым центром, складчатая, влажная, блестящая, матовая, сухая);
–края (ровные, волнистые, зубчатые, бухтообразные, бахромчатые и др.);
–прозрачность (прозрачные, полупрозрачные и непрозрачные);
–цвет(синеватые, серовато-синеватые, серые, беловато-серые, желтые, оранжевые и др.)
Характер роста по уколу.
Характер роста по уколу указывает на отношение микроба к кислороду воздуха: аэробы растут в виде гвоздя, шляпкой вверх, факультативные анаэробы растут равномерно по всему уколу,
облигатные(строгие) анаэробы–в нижней части укола. При
выращивании на желатине одни виды бактерий(протеолитические)его разжижают, другие – не разжижают.
Приготовить мазки и окрасить их по Граму.
Из колоний, выросших при выделении чистой культуры, готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют при максимальном увеличении микроскопа для установления однородности формы микробных клеток. Увиденное в микроскопе зарисовывают в тетрадь.
Вопросы для самоконтроля
1. Как проводится посев микроорганизмов на плотные питательные среды?
2.Как проводится посев микроорганизмов на жидкие питательные среды?
3.Что называется чистой культурой микроорганизмов?
4.Каково назначение чистых культур микроорганизмов?
5.Как выделяются чистые культуры по методу Коха?
6.Какие приемы предосторожности против заражения исследуемого материала посторонними микроорганизмами используются при посевах?
Лабораторная работа № 8 Методы количественного учета микроорганизмов
Цель работы: Научиться проводить количественный учет микроорганизмов с помощью счетных камер и измерения величины микробных клеток с помощью окуляр -микрометра.
Задание:
1. Провести количественный учет клеток дрожжей, содержащихся в предоставленной суспензии (подсчет клеток дрожжей в исходной (неразбавленной) суспензии и суспензии, разбавленной в 2,5 и 10 раз в трехкратной повторности.
2. Подсчет клеток дрожжей в счетной камере Горяева при объективе
20 или40.
3. Определить: 1) цену деления окуляр - микрометра с помощью объектив - микрометра; 2) величину, размеры дрожжей.
4. Оформление протокола исследования.
О росте микроорганизмов в естественных субстратах или в питательных средах судят по изменению количества их клеток или биомассы в единице объема. Методы определения этих показателей могут быть прямыми (подсчет клеток под микроскопом, взвешивание) или косвенными. Косвенные методы основаны на измерении параметров, величина которых зависит от количества или биомассы микроорганизмов (число колоний, выросших после посева суспензии клеток на питательную среду, рассеяние или поглощение суспензией света, содержание в ней белка и т. д.). Выбор метода зависит от целей исследования, свойств питательной среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии микроорганизмов. Так, многие методы, используемые для определения числа одноклеточных микроорганизмов, неприемлемы при подсчете многоклеточных (нитчатых, мицелиальных и других форм).
При оценке численности микроорганизмов, особенно в естественных субстратах (прежде всего в почве), необходимо помнить, что их клетки часто находятся в прикрепленном (адгезированном) состоянии или в виде микроколоний. Поэтому перед началом подсчета их нужно отделить от частиц субстрата и друг от друга (десорбировать). Выбор метода десорбции (механическое перемешивание суспензии клеток, растирание, обработка ультразвуком, применение поверхностно-активных веществ и т. д.) определяется особенностями исследуемого субстрата.
Точность любого метода определения числа микроорганизмов ограничена ошибкой метода, которая возникает вследствие случайного распределения клеток в суспензии и является результатом ограниченного числа подсчитываемых клеток, а также связана с техническими ошибками, т. е. неточностью в приготовлении разведений, неправильным монтажом камеры, повторным учетом одной и той же клетки (колонии) и т. д. Ошибки метода неизбежны, тогда как технические ошибки зависят главным образом от качества работы исследователя. Следует помнить, что статистическая обработка результатов возможна только при минимальной технической ошибке. Чашечный метод и метод предельных разведений требуют особой чистоты и аккуратности при выполнении всех операций. Необходимо
тщательно оберегать пипетки, пробирки и среды от заражения микроорганизмами из воздуха, так как каждая случайно попавшая клетка может заметно повысить число микроорганизмов в исследуемом субстрате.
Практическая часть
Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского – Брида)
Этот метод применяется в различных модификациях для определения численности микроорганизмов в разнообразных естественных субстратах – почве, загрязненной воде, оптически непрозрачных средах, содержащих нерастворимые в воде компоненты, например, крахмал, соевую муку. Преимущество метода заключается также в том, что фиксированные окрашенные препараты могут долго храниться, поэтому подсчет можно производить в удобное для исследователя время.
Приготовление препарата
Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой размечен прямоугольник площадью 4 или 6 см². Затем на стекло наносят точно отмеренный объем
исследуемой суспензии (обычно от 0,02 до 0,05 мл) и в некоторых случаях добавляют каплю 0,03…0,1%-го водного раствора агара. Нанесенную суспензию равномерно распределяют петлей по площади, отмеченной на миллиметровой бумаге. Препарат подсушивают на воздухе, фиксируют от 10 до 20 минут 96%-ным спиртом и окрашивают эритрозином, метиленовым синим или фуксином в течение двух минут. Затем препарат промывают, последовательно погружая стекло в 4-5 сосудов с водой (промывать под проточной водой не следует), и высушивают на воздухе. В таком виде препараты хорошо сохраняются.
Правила подсчета
Препарат микроскопируют с иммерсионным объективом. При этом подсчитывают количество клеток в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами. При отсутствии сетки подсчитывают число клеток в поле зрения микроскопа. Правила подсчета в квадратах окулярной сетки то же, что и в квадратах сетки счетной камеры. Чтобы результат был достоверным, клетки микроорганизмов рекомендуется подсчитывать в 50 – 100 квадратах сетки (не менее десяти полей зрения), передвигая препарат по диагонали. При отсутствии сетки подсчитывают число клеток на всей площади поля зрения микроскопа. Общее количество подсчитанных клеток не должно быть менее 600. Количество клеток
микроорганизмов в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:
(1)
где М – количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата; а – среднее количество клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения);
s – площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения), мм²; V – объем нанесенной на стекло суспензии, мл;
S – площадь мазка, мм²;
n – коэффициент разведения исследуемого субстрата.
Площадь квадрата сетки (поля зрения) определяют с помощью объективного микрометра, который помещают на столик микроскопа вместо препарата, и при том же увеличении, при котором проводили подсчет, измеряют сторону квадрата сетки или диаметр поля зрения. Площадь поля зрения вычисляют по формуле s = πr².
Определение микробного числа почвы
Стерильную расплавленную среду МПА (для выявления бактерий) и сусло – агар СА(для выявления дрожжей и плесневых грибов) разливают каждую в 3 стерильные чашки Петри (всего 6 чашек). Навеску почвы, взятую в асептических условиях, суспендируют 2 мин в 100 мл стерильной водопроводной воды. Дают отстояться частичкам почвы в течение 5-10 мин. Из надосадочной жидкости отбирают 1 мл и переносят в другую пробирку, заполненную 9 мл стерильной водопроводной воды (разведение 1:103). Встряхивают суспензию, отбирают 1 мл надосадочной жидкости и переносят в третью пробирку с 9 мл воды (разведение 1:104). Посев производят из второй или третьей пробирки на выбор: 0,05 мл суспензии соответствующего разведения наносят на поверхность питательного агара в чашке Петри и размазывают стерильным шпателем Дригальского по поверхности плотной питательной среды (МПА и СА). Чашки переворачивают вверх дном, и чашки с МПА инкубируют при 37° С 48 ч, а с СА выдерживают при 24° С 6-7 суток. Подсчет выросших колоний проводится на следующем занятии.
Определение микробного числа воздуха
Методы микробиологического исследования воздуха подразделяют на седиментационные и аспирационные. Наиболее простым является седиментационный метод Коха: стерильные чашки Петри с плотной питательной средой открывают в местах отбора проб воздуха и выдерживают в течение определенного времени (5-30 мин), после чего закрывают и термостатируют.
По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха, пользуясь правилом Омелянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность питательной среды площадью 100 см2 в течение 5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их