Задание
1.Провести посев в мясо-пептонный бульон(МПБ).
2.Провести посев на скошенный мясо-пептонный агар.
3.Провести посев петлей на среду в чашку Петри.
4.Провести посев исследуемого материала в толщу плотной питательной среды.
5.Провести посев уколом в столбик питательной среды.
6.Провести посев шпателем или тампоном на среду в чашку Петри.
7.Выделить чистую культуру микроорганизмов.
8.Выделить чистую культуру методом рассева в глубине среды.
9.Выделить чистую культуру по методу Дригальского.
10.Описать полученные посевы микроорганизмов.
11.Приготовить мазки и окрасить их по Граму. Результаты зарисовать в тетрадь.
Жидкий материал для посева берут стерильной петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовывать в кольце петли прозрачную пленку – «зеркало». Пипетки используют в том случае, когда материал засевают в большом количестве или в точно отмеренном объеме. Иногда материал, который используется для посева, распределяется в жидкости неравномерно, образуя поверхностно плавающую пленку или придонный осадок. В таких случаях для пересева нужно взять небольшую частицу пленки или несколько крупинок осадка. Способ взятия материала для посева с плотной среды определяется ее консистенцией. При взятии материала из структур, которые имеют плотную консистенцию, их поверхность прижигают раскаленным ножом или скальпелем.
На обожженной поверхности делают подрез и из середины исследуемого материала вырезают стерильными ножницами или скальпелем кусочек ткани. Из органов мягкой или рыхлой консистенции материал для посева берут петлей. Кусочки взятого для посева материала опускают в жидкую питательную среду или растирают в стерильной ступке, получая кашеобразную массу, используемую для посева. С плотной питательной среды материал для посева можно брать так же иглой. Техника посева зависит от консистенции питательной среды, качества засеваемого материала и цели исследования. Все посевы производят в боксе или лабораторной комнате, в которой в этот период времени ограничивается движение персонала. Все манипуляции, связанные с посевом и выделением микробных культур, производят над пламенем спиртовки.
Непосредственно перед взятием материала бактериальную петлю прокаливают над пламенем, затем ее остужают, потирая о внутреннюю стенку пробирки или поверхность крышки от чашки Петри, и проверяют, достаточно ли она охладилась. Для этого при пересеве микробной культуры с пробирки петлю погружают в конденсационную
жидкость или, при посеве с чашки Петри, прикасаются к поверхности питательной среды, свободной от микроорганизмов. Остуженная петля не вызывает изменения конденсата и не расплавляет питательный агар. Окончив посев, петлю прожигают повторно для уничтожения оставшихся на ней микроорганизмов и ставят в штатив. Шпатели, используемые для посева, перед посевом прожигают также, как и бактериальные петли. Пипетки стерилизуют в завернутом состоянии в сушильном шкафу. После проведения посева шпатели и пипетки опускают в дезинфицирующий раствор. Чистой культурой называется выращенная масса клеток, состоящая из микроорганизмов, принадлежащих к одному виду и образовавшихся в результате деления одной клетки.
Получение чистых культур необходимо для определения видовой принадлежности микроорганизмов. Существует несколько методов получения чистых культур микроорганизмов, различающихся между собой способами получения отдельных клеток микроорганизмов. В микробиологической практике выделение чистых культур проводят методом пластинчатых культур Коха, иначе называемым чашечным методом истощающего посева. Существуют различные варианты этого метода, но при любом из них в каждую следующую чашку Петри вносят все меньшее количество микроорганизмов. При выращивании посевов клетки размножаются, и из каждой из них образуется масса клеток, называемая колонией. Каждая обособленная колония представляет собой потомство одной клетки и поэтому является чистой культурой того вида, к которому принадлежала исходная клетка. Такие колонии хорошо видимы невооруженным глазом или их можно рассмотреть с помощью луп. Завершающим этапом выделения чистых культур является пересев выросших на чашках Петри колоний в пробирки с жидкой питательной средой, которые являются накопительными. Так выделяются аэробные и факультативноанаэробные микроорганизмы. Для выделения чистых культур строгих анаэробов микроорганизмы, засеянные на чашке Петри, выращиваются
ванаэробных условиях.
Внастоящее время для выделения чистых культур микробов наиболее часто пользуются методом рассева в глубине питательной среды, являющимся модификацией пластинчатого метода Коха, и методом посева на поверхность питательной среды– методом Дригальского.
Практическая часть
Провести посев в мясо-пептонный бульон(МПБ).
Берут петлю, обжигают ее в пламени спиртовки и вводят в
емкость, в которой находятся микроорганизмы, затем охлаждают и берут материал для посева. Если материал для посева жидкий, то его набирают в стерильную пастеровскую или градуированную пипетку.
Петлю и пипетку держат тремя пальцами правой руки(большим, указательным и средним). В левую руку берут пробирку с жидкой питательной средой и открывают пробку пальцами правой руки, прижав ее мизинцем к ладони или держа между указательным пальцем и мизинцем.
Осторожно вводят петлю или пипетку в пробирку с питательной средой и погружают в нее. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Из пипетки материал для посева вливают. После проведения посева пробирку закрывают пробкой, которую в течение всего посева держат в руке, и содержимое тщательно перемешивают, осторожно встряхивая, чтобы не замочить пробку, или вращая сначала в одну, затем в другую сторону. При посевах культур, растущих в виде поверхностной пленки, последнюю очень осторожно
снимают и опускают на поверхность свежей питательной среды, не давая погрузиться в глубь. Полученные посевы термостатируют в течение 24 часов при температуре 37 °С.
Провести посев на скошенный мясо-пептонный агар.
В правой руке, как писчее перо, держат петлю, предварительно прокаленную в пламени горелки и охлажденную, с взятым для посева материалом. Пробирку держат между большим и указательным пальцами левой руки так, чтобы ее основание находилось на поверхности кисти. Посев осуществляют под контролем глаз. Мизинцем и безымянным пальцем правой руки вынимают из пробирки пробку, держа ее за наружный конец, не прикасаясь к части пробки, которая входит внутрь пробирки. Пробку вынимают над пламенем горелки, после чего обжигают ее края.
Нужно следить затем, чтобы пробка ни к чему не прикасалась. Затем вводят петлю с материалом для посева в пробирку до дна и делают посев или на поверхность питательной среды, или в конденсационную воду. Пересев культуры из одной пробирки в другую осуществляется аналогично. Только в левую руку берут сразу две пробирки, а затем правой рукой(мизинцем и безымянным пальцем) вынимают сразу две пробки. Полученные посевы термостатируют 24 часа при температуре 37 °С.
Провести посев петлей на среду в чашку Петри.
При проведении посева на поверхность плотной питательной среды в чашку Петри чашка стоит на столе. Левой рукой приоткрывают ее крышку с одной стороны так, чтобы в щель могла пройти петля, на которой находится материал для посева. Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды. Посев делают одним из трех способов:
–штрихом: петлей проводят зигзагообразную линию, свободно скользя по поверхности среды от одного края чашки Петри к другому;
–чертой: проводят петлю по прямой линии посредине питательной среды;
–сплошной: растирают материал непрерывными движениями петли по всей поверхности среды.
Затем петлю вынимают из чашки Петри и закрывают ее.
Прокаливают петлю в пламени горелки и ставят ее на место. Полученные посевы термостатируют 24 часа при температуре 37 °С.
Провести посев исследуемого материала в толщу плотной питательной среды.
Материал, засеваемый в толщу питательной среды, должен быть
вжидком состоянии. Для этого из материала, подлежащего посеву, готовят взвесь (в стерильной воде или физиологическом растворе), затем набирают ее в стерильную пипетку в объеме 0,1; 0,5 или 1мл(в зависимости от предполагаемого микробного загрязнения) и выливают
впустую стерильную чашку Петри. После этого чашку заливают мясопептонным агаром (10–15 мл), предварительно расплавленным и остуженным до 40–45 °С(если приложить колбу со средой к руке, то она не должна вызывать ощущения ожога, т.е. рука недолжна отдергиваться). Для равномерного распределения материала в среде чашку Петри прижимают за крышку к столу и делают круговые вращения, следя за тем, чтобы содержимое не попало на крышку. Полученные посевы термостатируют 24 часа при температуре 37 °С.
Провести посев уколом в столбик питательной среды.
Посев уколом в столбик делается иглой. В правой руке, как писчее перо, держат иглу, предварительно прокаленную в пламени горелки и охлажденную, с взятым для посева материалом. Пробирку с питательной средой(мясо-пептонный агар, желатин и др.), застывшей в виде столбика,берут в левую руку, открывают пробку(как указано выше) и в центре среды до дна пробирки вкалывают иглу с находящимся на ней материалом. Полученные посевы термостатируют 24 часа при 37 °С.
Провести посев шпателем или тампоном на среду в чашку Петри.
При помощи петли исследуемый материал вносят на поверхность питательной среды у края чашки Петри, а затем шпателем или тампоном распределяют его равномерно по всей поверхности агара. При большом количестве бактерии растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название сплошного, или газонного. Посев газоном
производят в том случае, когда нужно получить большое количество микробной культуры одного вида.
Выделить чистую культуру микроорганизмов.
Существует несколько методов выделения чистой культуры микроорганизмов. Наиболее распространенными среди них являются выделение чистой культуры методом рассева в глубине среды, а также выделение чистой культуры по методу Дригальского и в его модификациях.
Выделить чистую культуру методом рассева в глубине среды.
Берут 3–5 пробирок, в которых находится по 5–10 мл питательного желатина или мясо-пептонного агара и расплавляют их содержимое на водяной бане. Пробирки с расплавленной средой охлаждают до 43–45 °С и ставят в теплую воду, чтобы предупредить застудневание. В одну из пробирок стерильной пипеткой или петлей вносят исследуемый материал. Затем другой стерильной пипеткой или петлей часть содержимого первой пробирки переносят во вторую, из второй – в третью и т. д. Засеянные пробирки со средой хорошо перемешивают, зажав их между ладонями (вращают несколько раз то в одну, то в другую сторону). Приготовленные таким образом разведения бактерии выливают из пробирок в чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерами пробирок. После загустевания среды чашки помещают в термостат и термостатируют 24 часа при температуре 37°С.Количество выросших в чашках Петри колоний
уменьшается по мере увеличения разведения взятого на посев материала.
Выделение чистой культуры по методу Дригальского.
Расплавленную питательную среду разливают в 3 чашки Петри с толщиной слоя не менее 0,5 см. Застывшую среду обязательно подсушивают. В первую чашку петлей вносят небольшое количество исследуемого материала и шпателем Дригальского или шпателем, сделанным из пастеровской пипетки, втирают его в поверхность питательной среды. Затем шпатель(не обжигая и не набирая нового материала) переносят сначала во вторую чашку, а затем в третью. В каждой из них оставшийся на шпателе материал втирают в поверхность питательного агара. Вместо шпателя можно использовать бактериальную петлю. Для этого ее с небольшим количеством микроорганизмов кладут плашмя на питательную среду и проводят, не повреждая поверхности, штрихи по всей среде или по секторам, разделив дно чашки(если среда прозрачна) на 4 или 8 равных частей. Штрихи можно проводить в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет