Метаболическое разнообразие связано с наличием ферментов и ферментных систем. Известные ферменты Прокариот относят к 6 классам: Оксидоредуктазы (окислительно-восстановительные ферменты). Трансферазы ( перенос функциональных групп от одной молекулы к другой). Гидролазы (гидролиз). Лиазы (отщепление функциональной группы с образоваием двойной связи и присоединения радикала по месту двойной связи). Изомеразы (изомеризация). Лигазы (осуществляют реакции синтеза=синтетазы) В микробной клетке ферменты могут функционировать изолировано друг от друга или могут быть связаны в полиферментные цепи. Например: АТФазный комплекс, ферменты дыхательной цепи. Ферменты связаны как структурно, так и функционально. Максимальная активность проявляетс только в комплексе. Выделение фермента приводит к потере активности. В зависимости от места действия фермента различают экзо- (экспортируются клеткой во внешнюю среду) и эндоферменты (функционируют внутри клеток). Микроорганизмы имеют определѐнный набор ферментов, которые являются генетически закрепленными. Различают конститутивные ферметы – синтезируются клеткой постоянно с постоянной скоростью, без них клетка существовать не может. Это ферменты основных метаболических путей клетки. Кроме этого присутствуют индуцибельные ферменты – синтезируются и активируются только в присутствии индуктора, т.е. только когда есть необходимость, в отсутствии же индуктора гены, которые кодируют синтез данного фермента, неактивны, находятся в репрессированном состоянии, а индуктор снимает репрессор.
В таблице представлены некоторые нормы физико-химических показателей дрожжей.
Таблица Нормы физико-химических показателей хлебопекарных дрожжей ( по ГОСТ 171-81)
Наименование показателя |
норма |
Влажность в день выработки, не более,% |
75 |
Подъемная сила, мин, не более |
70 |
Кислотность100 г. дрожжей в пересчете |
120 |
на уксусную кислоту, в день выработки, |
|
мг, не более |
|
Кислотность 100 г. Дрожжей в пересчете |
300 |
на уксусную кислоту, на 12-е сутки |
|
хранения при температуре от 0 до +4ºС, |
|
мг, не более |
|
Практическая часть
В наше время биомассу дрожжей выращивают на мелассе – отходе производства сахара из сахарной свеклы, содержащем сахарозу. Сахароза является дисахаридом, который не может транспортироваться через цитоплазматическую мембрану. Для вовлечения сахарозы в
метаболизм дрожжи вырабатывают фермент инвертазу (сахаразу), которая расщепляет этот дисахарид на глюкозу и фруктозу. Дрожжи Saccharоmyces cerevisiae, выпускаемые для хлебопечения, по органолептическим и физико-химическим качествам должны соответствовать определенным нормам, которые прописаны в ГОСТ
171-81.
Определение подъемной силы дрожжей ускоренным методом
Каждая пара студентов получает свое задание: разные дрожжи с различным сроком годности.
Методика эксперимента: на электронных весах взвесить 0,31 г дрожжей, перенести в фарфоровую чашку, прилить 4,8 мл 2,5% раствора хлорида натрия, нагретого до 35 °С, и тщательно перемешать шпателем или пестиком. К полученному раствору добавить 7 г муки, замешать тесто и придать ему форму шарика. Шарик опустить в стакан
с200 мл воды, нагретой до температуры 35 °С, и поместить в термостат
стой же температурой. Отметить время, прошедшее с момента погружения шарика на дно стакана, до момента его всплывания. Время подъема шарика в минутах умножить на коэффициент 3,5, полученный эмпирически для определения подъемной силы.
Определение кислотности дрожжей
Студенты проводят опыт с теми же дрожжами, которые были выданы ранее.
Методика эксперимента: Взвесить 10 г. дрожжей, поместить в колбу вместимостью 100 мл, залить 50 мл дистиллированной воды и перемешать. Титровать 0,1 н. раствором NaOH в присутствии фенолфталеина до розового окрашивания. При титровании колбу необходимо непрерывно встряхивать для поддерживания однородности суспензии.
Все результаты опытов записывают в тетради, сравнивают и делают соответствующие выводы о соответствии дрожжей различного срока годности стандартам, а также о влиянии условий хранения дрожжей на их физико-химические показатели.
Качественное определение фермента инвертазы
В пробирку налить 2 мл 6.5% раствора сахарозы, добавить 0,5 мл раствора фермента. Через 10 минут в пробирку добавить 3 мл раствора 8%-ного сульфата меди, 3 мл 3%-го раствора сегнетовой соли(двойной виннокислой соли калия-натрия)в 2 н. растворе гидроксида натрия, перемешать и поставить пробирку на 3 минуты в кипящую водяную баню. В качестве контроля взять пробирку, в которой вместо фермента добавлено 0,5 мл дистиллированной воды. Контрольную пробирку также поставить на 3 минуты в водяную баню. Отметить изменения, произошедшие в растворе, отметить цвет осадка, самостоятельно написать уравнение процесса, отметить отсутствие изменений в контрольном растворе, написать причину изменений в опытном и отсутствия изменений в контрольном растворе.
Вопросы для самоподготовки
1.Какие энергетические процессы протекают в клетках дрожжей в анаэробных и аэробных условиях?
2. Какова роль ферментов в прокариотических клетках?
Лабораторная работа №4
Определение активности действия ферментов у эукариотических клеток
Цель: на основе изучения клеток бактерий (прокариот), растений и животных (эукариот) показать основные отличия в строении клеток прокариот и эукариот, а также обнаружить основные черты сходства в строении клеток бактерий, животных и растений как показатель единства организации живых форм.
Задание
Обосновать значение фермента каталазы в клетках растений и животных.
Оборудование: микроскопы, предметные и покровные стекла, пипетки, настой иода, стаканы с водой, пинцеты, скальпели, водные растворы туши, готовые препараты бактерий, фуксина, метиленового синего, настой различных естественных материалов (мяса, рыбы, овощей и др.), пленка лука или лист элодеи, готовые препараты животных тканей, свежий 3% раствор пероксида водорода.
Для изучения морфологии бактерий следует заранее приготовить настой из различных естественных материалов: мяса, рыбы, белка яйца, навоза, сена и др. небольшое количество материала измельчают, помещают в колбу, на кончик скальпеля добавляют немного мела и заливают водопроводной водой на 2/3 объема. Колбу с настоем выдерживают в термостате при 25-280С или в теплом помещении в темноте 3-5 дней. За это время в среде накапливается масса разнообразных бактерий.
На предметное стекло поместите каплю настоя, наиболее богатого микрофлорой (обычно это настой мяса или рыбы). Приготовьте временный препарат, рассмотрите при разных увеличениях.
Просматривая препараты, делайте зарисовки бактерий, обращая внимание на форму, взаимное расположение клеток и на соотношение размеров бактерий при разном увеличении микроскопа. Добавив в каплю настоя тушь, можно приготовить негативный тушевой препарат. В поле зрения микроскопа на общем темном фоне туши отчетливо видны неокрашенные клетки бактерий.
Настоящего ядра у бактерий нет, а имеется скопление хромосом, видны жировые включения, у некоторых бактерий видна капсула, представленная слизистым слоем, жгутики и т.д.
После рассмотрения и зарисовки клеток бактерий приготовьте временные препараты растительной и животной клеток. Используйте клетки кожицы лука. Рассмотрите препарат при малом увеличении. Будет видна на препарате группа вытянутых, почти прямоугольных клеток. Крупные округлые ядра в клетках окрашены йодом в желтый цвет.
Рассмотрите препарат при большом увеличении и найдите оболочку клетки. В ядре можно заметить 1-2 ядрышка, иногда видна зернистая структура цитоплазмы. Неокрашенные пустоты в цитоплазме клеток представляют собой вакуоли. Зарисуйте несколько клеток. Обозначьте оболочку, цитоплазму, ядро и вакуоли.
На препарате листа элодеи можно увидеть множество округлоовальных телец зеленого цвета. Это хлоропласты. Ядра в неокрашенных клетках не видны. Капнуть на микропрепарат пероксид водорода и снова рассмотреть под микроскопом. Объяснить наблюдаемое явление. Капнуть пероксида водорода на предметное стекло покрыть покровным стеклом и рассмотреть под микроскопом, описать наблюдаемую картину. Сравнить состояние пероксида водорода в листе элодеи и на стекле. Объяснить наблюдаемое явление. Нанести каплю пероксида водорода на мертвый лист (убитый кипячением) элодеи, опишите наблюдаемое явление.
Готовые микропрепараты животных тканей (эпителий) рассмотрите при малом и большом увеличении микроскопа. В поле зрения будут многоугольные клетки с тонкими оболочками. В центре клеток расположены ядра округлой формы. Зарисуйте несколько клеток. На рисунке должны быть обозначены: оболочка, цитоплазма, ядро.
Приготовьте пять чашек Петри и пронумеруйте их. Поместите: в первую – немного речного песка;
вторую – кусочек сырого картофеля и измельченного сырого картофеля; третью – кусочек вареного картофеля и измельченного вареного картофеля;
четвертую – кусочек сырого мяса и измельченного сырого мяса; пятую – кусочек вареного мяса и измельченного вареного мяса.
Капнуть на каждую пробу 1–2 капли пероксида водорода. Понаблюдать что происходит. Сравнить активность измельченной и целой растительной и животной тканей. Составить таблицу, показывающую активность каждой ткани при различной обработке.
Вопросы для самоконтроля
1.Какие положения клеточной теории можно подтвердить результатами проведенной работы?
2.Как проявляется активность фермента в живых и мертвых тканях? 3. Каково значение фермента каталаза в живых организмах?
Лабораторная работа №5
Определение специфичности действия ферментов