Материал: Казаков Е.Д., Карпиленко Г.П. - Биохимия зерна и хлебопродуктов

ГЛАВА 2

первые недели после отсаживания от матери скорость роста и увеличение массы тела зависят от накопления в теле белка. К рост-массовым показателям относят коэффициент эффек- тивности корма (КЭК) и коэффициент эффективности бел- ка (КЭБ). КЭК представляет собой отношение прибавки мас- сы животного (г) за определенное время к количеству потребленного за это же время корма. При использовании белка вместо корма расчет ведут с белком.

В таблице 7 представлено содержание незаменимых ами- нокислот в суммарных зерновых белках. Для всех альбуминов

характерно высокое содержание важнейших незаменимых аминокислот, в том числе лизина, треонина, метионина, изо- лейцина и триптофана, а из других аминокислот — глютами- новой и аспарагиновой. Наиболее высоким содержанием ли- зина выделяются суммарные альбумины овса, риса и проса, более низким — пшеницы, ячменя, сорго и ржи.

Таблица 7

Содержание незаменимых аминокислот в суммарных зерновых белках и потребность в них человека (%)

72

_________________________________________БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

В альбуминах ржи, сорго, риса много метионина; в альбу- минах овса, кукурузы, риса — изолейцина; в альбуминах пше- ницы, кукурузы, сорго, риса— триптофана. Треонин часто бывает дефицитной аминокислотой для злаковых культур, в альбуминах ячменя, ржи и овса его содержание высокое, в альбуминах пшеницы — самое низкое. Глобулины злаковых

также отличаются относительно высоким содержанием лизина. Вместе с тем у пшеницы, проса, сорго, риса и овса эта фракция белков лизином представлена беднее, чем альбуми- новая тех же видов.

Глобулины бобовых содержат высокий процент лизина (соя — до 6%). Вместе с тем глобулиновая фракция содержит

значительно меньше триптофана и метионина по сравнению с альбуминами. Однако для бобовых характерен высокий уровень аргинина (кукуруза 12,5%, просо 13,3%, рис 16,6%), аспараги- новой и глютаминовой кислот и очень низкий — пролина.

Альбуминовая и глобулиновая фракции представляют со- бой гетерогенные комплексы белков. Альбумины и глобули- ны играют существенную роль во всех проявлениях жизнедея- тельности зерна.

В пшеничной муке высшего сорта, почти полностью лишен- ной зародыша, алейронового и субалейронового слоев, число ут- раченных ферментов достигает нескольких сот. Среди них зна- чительное количество амилаз и протеаз. Альфа-амилаза в виде группы изозимов* составляет около 0,1%, бета-амилаза— около 0,5% общего белка. Очень малые количества протеолитических ферментов активизируются в процессах развития и жизнедея- тельности зерновки. Из других ферментов следует отметить фи- газы алейронового слоя, а также пептидные гидролазы.

Характерная особенность проламинов — низкое содержа- ние лизина, которого очень мало в проламинах пшеницы, сорго и ржи. Еще беднее этой аминокислотой зеин кукурузы и пани- цин проса: в них обнаружены лишь следы лизина. Низкое со- держание лизина в проламинах и высокий процент этой фрак-

* Изозимы (изоэнзимы, изоферменты) — ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но различающиеся по структуре и физико-химиче- ским свойствам.

73

ГЛАВА 2

ции в белках большинства злаков — основная причина их не- сбалансированности по лизину. Проламины также бедны тре- онином и триптофаном. Относительно богат триптофаном паницин проса. Триптофан практически отсутствует в зеине кукурузы и кафирине сорго.

Пеструю картину дает содержание в проламинах отдельных культур серосодержащих аминокислот (цистина, цистеина и метионина). В глиадине пшеницы найдено 1,9% цистина, в секалине ржи 2%, авенине овса 4,4%. В паницине проса и ори- зенине риса обнаружено немного цистина, а в кафирине сорго

— лишь его следы. Значительные расхождения по содержанию в проламинах злаков лейцина. В проламинах большинства зерен злаковых культур наблюдается высокий уровень лейци- на, прежде всего в зеине, кафирине и оризенине (17—18%). Мало лейцина содержат секалин, гордеин и паницин. Внешние факторы мало изменяют аминокислотный состав пролами- нов — при разных условиях азотного питания они имеют тот же аминокислотный состав.

Проламины, как и другие белковые фракции, представля- ют собой сложную смесь белковых компонентов. Для прола- минов характерна видовая и сортовая специфичность их ком- понентного состава. Эта особенность положена в основу

геномного анализа пшеницы для определения подлинности и сортовой чистоты семян по электрофоретическому спектру глиадинов. Разработана карта белков, при помощи которой различают, какими хромосомами контролируется синтез от- дельных глиадиновых компонентов у мягкой пшеницы.

Значительный удельный вес в общем белковом фонде зер- на злаковых приходится на фракцию глютелинов. Особен- ность глютелинов в том, что по аминокислотному составу они

занимают промежуточное положение между проламинами и глобулинами. Содержание лизина в них больше, чем в прола- минах: в глютенине пшеницы, ржи и ячменя составляет (со- ответственно) 1,7; 2,3 и 4%, в глютенине кукурузы, сорго, ржи, и проса— 2,4; 3,1; 4; овса— 5%. Глютелины отличаются от проламинов более высоким содержанием аргинина, гисти- дина, гликокола. По аминокислотному составу белок глюте- линов сбалансирован лучше, чем у проламинов.

БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

Более подробно изучены состав и свойства глютелинов пшеницы в виде изолированной фракции и в составе клейко- вины — глиадиново-глютенинового комплекса. Содержание лизина в глютенинах пшеницы, как и в глиадинах, невысокое.

На долю обеих фракций в пшеничной муке приходится более 80% белка и в целом зерне 50—60%. В связи с этим белки пше- ницы бедны лизином.

Полноценность зерна риса по аминокислотному составу находится на удовлетворительном уровне: у шлифованного риса 80% всего белка составляют глютелины оризенины, со- держащие 2,6—4% лизина. Преобладающие фракции овса — глобулины и глютелины, в которых содержится до 5,5% лизи- на, что приводит к хорошей сбалансированности овса по этой наиболее дефицитной аминокислоте.

§ 10. ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

Для выделения белков биологический материал измель- чают до разрушения клеточных стенок, получая гомогенат. Для этой цели применяют следующие способы: растирают ткани с твердым материалом — абразивом (кварцевый песок) и ступке; используют специальные вальцовые или шаровые мельницы, вращающиеся с большой скоростью острые ножи; продавливают в замороженном состоянии через фильеры спе- циального пресса; применяют ультразвуковые дезинте- граторы и др. При разрушении биологических тканей и вы-

делении белков всегда необходимо иметь в виду их большую неустойчивость, лабильность, склонность к утрате нативных свойств — денатурации. Затем пробу обезжиривают и при- ступают к извлечению белков. Наиболее часто белки извле- кают водой или солевыми растворами. Для извлечения бел- ков используют также спирто-водные смеси.

В состав биологических тканей входит множество белков. Большие трудности составляет разделение суммарной белко- вой смеси на индивидуальные белки — их фракционирование. Известно много методов фракционирования белков: органи- ческими растворителями, электрофоретические, хроматогра- фические, молекулярными ситами (сефадексами) и др.

ГЛАВА 2_____________________________________________________________

Фракционирование органическими растворителями. Для это-

го применяют этанол, ацетон, диоксан и другие в строгих ус- ловиях рН и температуры.

Электрофоретические методы. Основаны на движении заряженных молекул белков в электрическом поле. Скорость

перемещения молекул белка зависит от величины их зарядов при определенном рН и ионной силе раствора. Некоторое вли- яние оказывают форма и масса белковых молекул. Электрофо- рез проводят в растворе или на твердых влажных средах — в геле из крахмала, производных целлюлозы, полиакриламида (ПААГ), силикагеля, на хроматографической бумаге. Большая дробность фракционирования белковых смесей вплоть до вы- деления индивидуальных белков достигается при разновидно- сти электрофореза, называемого изоэлектрическим фокусиро- ванием. Здесь разделение белков происходит в поддерживающих средах с определенным градиентом рН, что обеспечивает поло- жение белка на определенном уровне в колонке. Градиент рН создают с помощью полиаминополикарбоновых кислот— ам- фолинов, дающих диапазон рН от 3 до 10.

Хроматографические методы. Основаны на разделении сме-

си веществ на основе их физико-химических различий между двумя фазами, одна из которых неподвижная, а другая — по- ток, фильтрующийся через неподвижную фазу. При жидко- стной хроматографии подвижной фазой бывает жидкость, при газовой — газ. Существует несколько видов хроматографии.

При адсорбционной хроматографии разделение смеси веществ происходит в результате различия их физической сорбции. При помощи распределительной хроматографии вещества из сме-

си распределяются между двумя разными не смешивающимися жидкостями.

Принцип ионно-обменной хроматографии — ионные вза- имодействия между растворенными веществами и носителем. В химии белков наиболее часто применяют ионообменную, молекулярно-ситовую (гель-проникающую) и аффинную хроматографию. При ионообменной хроматографии белки взаимодействуют с противоположно заряженными частица- ми ионообменных смол (ионитами) — твердых нераствори- мых веществ, заполняющих колонку, и вследствие этого раз-

76

________________________________________БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

деляются. Ионообменник имеет иониты, содержащие актив- ные группы основного характера и подвижные анионы (ани- ониты), и иониты, в состав которых входят активные кис-

лотные группы и способные к обмену подвижные катионы (катиониты).

Гель-проникающую хроматографию (гель-фильтрацию) называют еще молекулярным ситом. С помощью этого метода белки разделяют по размерам их молекул.

При аффинной хроматографии (хроматографии сродства) специально подобранные твердые носители избирательно свя- зывают строго определенные белки. Аффинная хроматогра- фия позволяет очень точно фракционировать белки.

Выделение молекулярными ситами. Для этого берут сефа-

декс — специальный пористый материал, получаемый обра- боткой эпихлоргидрином полисахарида декстрана.

В колонку, содержащую сефадекс (рис. 11), частицы кото-

рого окружены водной оболочкой и уравновешены буферным

Рис. 11. Механизм разделения веществ по молекулярной массе на колонке с сефадексом:

а — колонка в начале работы. Светлыми кружками обозначены зерна сефа- декса, темными точками — молекулы белков разной молекулярной массы, толь- ко что внесенных в верхнюю часть колонки; б- по мере продвижения прояви- теля по колонке (сверху вниз) осуществляется перенос молекул белков, однако только меньшие молекулы белков проникают внутрь зерен сефадекса; в — мелкие молекулы белков резко отстают от крупных его молекул, задерживаясь в зернах сефадекса. Первыми из колонки выйдут большие молекулы

77

ГЛАВА 2____________________________________________________________

раствором, вносят раствор смеси двух веществ разной молеку- лярной массы — белок и, например, соль. При фильтровании через гель сефадекса низкомолекулярное вещество (соль) мед- ленно диффундирует через поры набухших в воде частиц се- фадекса. Более высокомолекулярное вещество (белок) быст-

рее просачивается между частицами сефадекса и получается в свободном от низкомолекулярных примесей виде. При после-

дующем промывании колонки тем же буферным раствором медленно диффундирующее низкомолекулярное вещество (соль) удаляется. Таким образом регенерируют колонку. Вы- деленные белки часто содержат различные примеси. Для их удаления применяют очистку белков с помощью диализа, элек- тродиализа, ультрафильтрации.

Очистку диализом проводят следующим образом. Диали- зационный мешочек из полупроницаемого материала (целло- фана и др.), в который помещают исследуемое вещество, по- гружают на несколько суток в сосуд с проточной водой. Низкомолекулярные соединения и ионы отмываются, а круп- ные молекулы белка остаются в мешочке.

Наиболее быстрого и полного удаления ионов добиваются при помощи электродиализа (рис. 12). Кроме полупрони- цаемых мембран, ставят электроды, на них подают напряже- ние. В результате ионы переходят в омывающую мембрану воду и удаляются из аппарата. Для очистки белков методом

ультрафильтрации используют полупроницаемые мембраны высокой прочности с калиброванными порами, через кото- рые белковый раствор продавливают сжатым газом или цен- тробежной силой. При насыщении белкового раствора солью белки можно получить в кристаллическом виде. Ранее упо- минавшаяся гель-фильтрация с сефадексом также дает хоро-

шие результаты при очистке белков от низкомолекулярных примесей.

Каждый индивидуальный белок состоит из одного вида молекул, имеет определенную молекулярную массу, состав и строение. Это диктует необходимость оценки гомогенности, т. е. однородности выделенных и очищенных белков. Для это- го применяют большое число методов, общим признаком ко- торых является выявление физико-химических особенно-

78

________________________________________ БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

Рис. 12. Установки для очистки белка путем диализа (а) и электродиализа (б): 1 - трубка для подведения воды; 2 — корпус диализатора; 3— диализационный мешочек; 4 — трубка для отвода воды и регулирования ее уровня; 5 — капил- лярная трубка, А — диализационная камера; Б — корпус электродиализатора; а и а1, — полупроницаемые мембраны; б и б1, — электроды (стрелками указано направление движения воды)

с гей, характерных только для гомогенного белка. Очень важ-

ным способом определения однородности белков является их исследование в ультрацентрифуге. Принцип работы ульт- рацентрифуги заключается в том, что раствор, содержащий белковые молекулы, подвергается мощному воздействию центробежной силы, превышающей приблизительно в 500 раз силу земного притяжения. При этом сначала осаждаются более тяжелые молекулы, затем — менее тяжелые.

С помощью ультрацентрифуги можно разделить белки, раз- личающиеся по молекулярной массе. Аналитическая ультра- центрифуга снабжена оптическим устройством, регистриру-

ющим результаты анализа в виде кривой при прохождении света через специальные ячейки, содержащие раствор иссле-дуемого белка. Однородный по молекулярной

массе белок при испытании в ультрацентрифуге на кривой дает один симметричный пик. Если на диаграмме получается два пика или один несимметричный, то это значит, что белковый препарат пред-ставляет собой смесь, по меньшей мере, двух белков. Для определения однородности белков широко

используют также

ГЛАВА 2

разные виды хроматографии, в том числе и ранее рассмотрен- ные. Для определения однородности белка необходимо при- менять разные методы.

§11 . БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА ЗЕРНА ПШЕНИЦЫ

Содержание белка в пшенице колеблется в широких преде- лах — от 9,2 до 25,8% (в среднем 13,5%). При вегетационных опытах удается получать зерно пшеницы с еще большим со- держанием белка. Зерно твердой пшеницы содержит белков больше, чем зерно мягкой. В стекловидных зернах мягкой пше- ницы белковых веществ не всегда больше, чем в мучнистых. Так, коэффициент корреляции между стекловидностью и со- держанием белковых веществ зерна пшеницы из разных райо-

нов РФ за несколько лет составил

и из стран Американского континента

Показатель стекловидности лабилен, более поддается вли- янию разнообразных внешних факторов, чем содержание бел- ка. По отдельным тканям зерна пшеницы белковые вещества распределены неравномерно (табл. 8). Наиболее богат белко- выми веществами алейроновый слой. Много белка также в за- родыше. Содержание белка в эндосперме меньше, чем в целом зерне.

Впределах эндосперма белок распределен также неравно- мерно. Если его периферические слои имеют высокую кон- центрацию белков, то центральная часть наиболее бедна бел- ками по сравнению со всеми остальными частями зерна. Так, субалейроновый слой твердой краснозерной пшеницы содер- жит 45% белка, а внутренний 11% (рис. 13).

Впартиях зерна озимой пшеницы по мере уменьшения размеров зерна относительное содержание в нем белка воз- растает. Наибольшее количество белка содержит неполно- ценное зерно (проход через сито с круглыми отверстиями

0 2,38 мм).

________________________________________ БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

Таблица 8

Содержание белка (средние данные) в морфологических частях зерна пшеницы, % сухого вещества

Вряде работ отмечено отсутствие четкой зависимости меж- ду размерами зерна пшеницы и содержанием в нем белка. Сле- дует учитывать многообразные формы проявления физиоло- го-биохимической разнокачественности зерна. Необходимо различать мелкое, но нормально развитое и щуплое зерно. Мелкое, нормально развитое зерно по своему составу и каче- ству ближе к здоровому, крупному, чем щуплое зерно. Измене- ния содержания белка и других признаков зерна в зависимо-

сти от размеров зерна могут быть выражены в разной степени

ине имеют строгой закономерности вследствие большой био- логической изменчивости зерна при созревании на материн- ском растении под влиянием многочисленных факторов.

Впределах сорта фракционный состав белков изменяется в зависимости от крупности зерна: с уменьшением размеров се- мян увеличивается содержание водо- и солерастворимых бел- ков и снижается содержание спирторастворимых белков. В зер- не пшеницы Аврора при диаметре семян 3 мм водорастворимых

исолерастворимых белков содержалось 27,8% и при диаметре семян 2 мм — 32,9%, а содержание спирторастворимых бел- ков соответственно было 26,1 и 20,0%. Аналогичные данные получены и по другим сортам. В соотношении между фракци- онным составом белка и крупностью зерна пшеницы различ- ных сортов такой закономерности не наблюдается. Здесь мож-