Материал: Казаков Е.Д., Карпиленко Г.П. - Биохимия зерна и хлебопродуктов

ГЛАВА 2_______________________________________________________________

Таблица 11

Аминокислотныйсостав белков клейковиныпшеницы, г на 100 г белка, содержащего 17,5% азота

ны нельзя объяснить особенностями аминокислотного соста- ва клейковинных белков.

Различают выход сырой и сухой клейковины. В зерне, в клет- ках эндосперма, содержащих клейковинные белки, глиадин и глютенин находятся между собой в тесной связи. При увлажне- нии муки в ней образуется как бы сетка, состоящая из набухших в

воде и теснейшим образом переплетенных между собой молекул глиадина и глютенина, а в просветах этой сетки заключена вода. Таким образом, клейковину можно рассматривать как набухший белковый комплекс, скрепляемый водородными, дисульфидны- ми, солевыми и другими связями. Влияние на структуру клейко- вины оказывают также гидрофобные взаимодействия.

Удельная растяжимость крепкой, нормальной и слабой клейковины снижается в результате дейтерирования соответ- ственно на 59,4—66,0 и 77,4% от ее величины, измеряемой при использовании обычной воды. При замешивании теста на тя- желой воде (99,78% D2O) укрепление клейковины происхо- дит тем больше, чем слабее исходная клейковина. Укрепление клейковины под влиянием D2O объясняется суммарным уве- личением прочности водородных связей в клейковинном бел- ке при замещении атомов водорода дейтерием.

В настоящее время с помощью современных методов разде- ления белков показано, что глиадин и глютенин состоят из ряда белков, различающихся по своей молекулярной массе и по аминокислотному составу. Удалось разделить глиадин на

БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

четыре основные фракции, обозначаемые как а-, б-, у- и w- компоненты.

В свою очередь каждый из этих компонентов может быть разделен на ряд индивидуальных белков, молекулярные мас- сы которых колеблются в пределах от 30000 до 160000. Глюте- нин также состоит из ряда белковых компонентов, молекуляр- ная масса которых значительно выше — 2—3 млн и больше.

Компоненты глиадина несколько различаются между со- бой по аминокислотному составу. Характерная особенность всех глиадиновых фракций — высокое содержание в них ос- татков глютаминовой кислоты (свыше 40%), пролина (свыше 20%) и малое число ионогенных групп, поскольку дикарбоно- вые кислоты почти полностью амидированы, а содержание основных аминокислотных остатков невелико. Наиболее от- личаются по аминокислотному составу w-глиадины, не содер- жащие метионина. Значительно меньше изучена другая фрак- ция клейковинного белка— глютенин.

Седиментационные измерения показали, что глютенин весьма гетерогенен по молекулярной массе. Он состоит из мно- гих белковых компонентов с молекулярной массой от 50 000 до 3 000 000. Электрофорез в крахмальном и полиакриламид- ном геле неприменим для анализа глютенина, молекулы ко- торого не мигрируют в гель и остаются на месте. По среднему аминокислотному составу глютенин близок к глиадину, одна- ко между ними имеются характерные различия. Глютенин бо- гаче глиадина основными аминокислотами (серином, треони- ном), глицином, триптофаном и тирозином, но беднее глютаминовой кислотой, пролином и фенилаланином.

Сравнительное исследование пептидов, полученных при протеолизе глиадина и глютенина методом хроматографии, показало, что белки обеих фракций имеют участки полипеп- тидных цепей с идентичной последовательностью аминокис- лотных остатков наряду с другими участками, первичная струк- тура которых специфична для каждого белка.

Вследствие различий в первичной структуре молекулы глюте- нина значительно сильнее ионизированы по сравнению с глиа- дином как в кислых, так и в щелочных растворах. Внутримолеку- лярные дисульфидные и водородные связи, образуемые

ГЛАВА 2

многочисленными амидными группами, наряду с низким содер-

жанием ионизированных групп стабилизируют относительно компактную конформацию глиадиновых молекул в растворе. В отличие от глиадина, молекулы глютенина характеризуются в растворах более рыхлой, слабо стабилизированной конформа- цией, свойственной высокомолекулярным полиэлектролитам в состоянии «беспорядочного клубка». В зависимости от рН, ион- ной силы, состава растворителя и других факторов молекулы глю- тенина изменяют свою конформацию в растворе в большей сте- пени, чем относительно более стабильные молекулы глиадина.

Глютенин и глиадин в отдельности не обладают характер- ными реологическими свойствами клейковины, и только со-

единение их в едином комплексе создает клейковинный белок со всеми присущими ему особенностями. Определено, что око- ло половины полипептидных цепочек клейковины связана ди- сульфидными мостиками, образуя полимерные молекулы раз- ной молекулярной массы, суммарно называемых глютенином. Вторая половина клейковины — глиадин — представлена в основном единичными полипептидными цепочками с внутри- молекулярными дисульфидными мостиками (рис. 14). Суще- ственную роль в формировании клейковины играют нековален- тные формы взаимодействия (водородные, солевые или ионные, а также гидрофобные взаимодействия).

Обилие нековалентных связей, легко разрываемых и вновь возникающих при различных воздействиях на белок, создает основу реологических свойств нативной клейковины — упру- гость, эластичность, связность, способность к обратимому ра- стяжению (упругой деформации).

Клейковина в некоторых средах полностью растворяется. В этом случае разрываются связи между одинаковыми по со-

ставу частицами клейковинного белка и происходит замена их связями клейковина — растворитель. В других растворителях происходит разрушение внутренней структуры белкового ком- плекса клейковины — разрыв связей между его компонента- ми. Обнаружена неодинаковая растворимость клейковины разного качества в определенных растворителях: чем крепче клейковина, тем ниже ее растворимость. Например, в 12%-ном

водном растворе салицилата натрия крепкая клейковина

БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

растворяется на 65—78%, клейковина нормальная — на 80— 90%, а слабая —на 91— 97%. Из этих данных вытекает, что креп-

кая клейковина отличается от слабой большей компактностью растворенных частиц и меньшей степенью их асимметрии, что

наглядно видно из величины удельного гидродинамического объема (объема, занимаемого в растворе гидратированным белком в расчете на единицу массы сухого белка):

До сих пор нет общепринятого представления о времени и месте формирования клейковины. Одни исследователи утвер- ждают, что клейковина образуется при отмывании клейкови-

ны из размолотого зерна в результате коллоидного процесса набухания и агрегации белковых веществ.

Другие — и таких большинство — убеждены в том, что клей- ковина синтезируется одновременно с общим ходом созрева- ния зерна.

Известные многочисленные теории формирования строе- ния и качества клейковины можно объединить в три группы.

Первая группа. Исследователи рассматривали в разных вари- антах клейковину как комплекс двух белков — глиадина и глю- тенина. Усилия авторов были направлены на выяснение харак- тера связи между ними, их взаимное расположение в составе клейковины, а также роль того и другого компонента в прида- нии определенных свойств клейковины как единому целому. Многие работы посвящены составу того и другого белка, осо- бенностям их взаимодействия. Было постепенно выяснено, что в структуре клейковины существенную роль играют нековален- тные взаимодействия в полипептидных цепях— водородные, солевые (ионные) связи, гидрофобное взаимодействие.

* Характеристическая вязкость (n)- мера гидродинамического сопротивле- ния потоку молекул высокополимера (в данном случае клейковины). Гидроди- намическое сопротивление — сила, возникающая при движении тела в жид- кости или несжимаемом газе, а также при течении жидкости или газа в канале.

ГЛАВА 2 _____________________________________________________________

Накоплен большой экспериментный материал, но выра- женных характерных особенностей того и другого, определя- ющих технологическое достоинство, обнаружить не удалось.

Вторая группа теорий строения клейковины расширяет представления о клейковине как о комплексе глиадина и глю-

тенина участием в образовании структуры клейковины других

еекомпонентов.

Сложились две группы исследователей. Одни авторы утвер-

ждают, что все вещества, обнаруженные в клейковине, обла- дают способностью влиять на ее структуру и свойства, но яв- ляются примесями и химически не входят в ее состав. Другие считают, что все они химически связаны с основными белка- ми глиадином и глютенином, входят в состав клейковины на равных правах с ними.

Многие исследователи поддерживают механизм образования клейковины, при котором около половины полипептидных це- пей связаны дисульфидными мостиками, что приводит к поли- мерным молекулам разной молекулярной массы, суммарно на- зываемой глютенином. Белок глиадин представлен в основном

единичными цепями с внутримолекулярными дисульфидными мостиками. Полипептидные цепи глиадина в разных местах

соединяются с полимеризованными молекулами глютениновой фракции, объединяя их в сложную трехмерную сетку, перепле- тающихся полипептидных цепей (рис. 14). Связи между глиади- ном и глютенином носят нековалентный характер (водородные, солевые или ионные, гидрофобные взаимодействия).

Изучали содержащиеся в клейковине липиды (природные и гидрогени- зированные), различные другие белки, липопроте- ины, гликолипиды, про-

входящих в состав зерна в виде кальциевых и магни-

евых солей, богатых фос-

96

______________________________________БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

фором, крахмалом, минеральные вещества, хлоропласты и др.

Наиболее широко изучалось влияние на структуру и свойства клейковины липидов с далеко идущим предложением — рас- сматривать клейковину как липидбелковый комплекс с веду- щей ролью в формировании клейковины липидов. И по этой группе исследований оказалось невозможным установить кон- кретные данные, обеспечивающие практическую возможность регулировать структуру и свойства клейковины.

Третья группа теорий о структуре клейковины объединяет усилия авторов, строящих свои выводы на углубленной основе с применением современных научных методов, применяемых в научных исследованиях на молекулярном уровне (хромато- графия, электрофорез, гельфильтрация на сефадексах, действие ферментов и др.).

В исследованиях были использованы также такие понятия и методы как комплементарность* белковых веществ, разделение

белков методами электрофоретического изучения на четыре зоны, соответствующие биохимические фракции (а, б, у, w) с номенклатурой и системой записи спектров белков, примене- ние иммунохимического** анализа, влияние липопротеиновых структурных мембран и т.д. Несмотря на богатство применен- ных методов в раскрытии ранее неизвестных особенностей клей- ковины, проведенные исследования также не решили главной проблемы клейковины — надежных средств регулирования и улучшения ее технологических свойств.

Исследователи, работающие с клейковиной, не замечают и не учитывают, что такой клейковины, какую они получают при отмывании из размолотого зерна, нет в зерновке.

Выделенная из зерна клейковина является для него чем-то инородным. В зерне не существует однородного тестовидного

* Комплементарность — взаимное соответствие в химическом строении двух макромолекул, обеспечивающих их взаимодействие (например, спари- вание двух нитей ДНК, соединение фермента с субстратом и др.).

** Иммунитет— невосприимчивость организма к инфекционным аген- там и чужеродным веществам, обусловленная наследственно закрепленными особенностями организма; иммунохимия изучает химический механизм иммунологических реакций и участвующих в них компонентов (главным образом белков и полисахаридов).

ГЛАВА 2_____________________________________________________________

куска и даже его частей. Мельчайшие разнообразные по составу частицы, главным образом на клеточном и межклеточном уров- нях будущей отмытой клейковины пронизывают все тело зер- новки, точнее его эндосперм. Клейковина в куске образуется при двух обязательных условиях: вычленение частиц будущей клей- ковины из сложного состава мучнистого ядра зерновки и обес- печение достаточным количеством воды для их набухания, в

ходе которого в образующейся отмываемой массе происходят многочисленные процессы, которых в ней не было, когда эти ее частицы были в зерне или они проходили по другому: биохими- ческие с участием ферментов, коллоидные, физические.

Состав и свойства клейковины радикально изменяются во времени. Очень важно различать изменения зерна и клейко- вины в поле и после уборки урожая.

Взерне и содержащейся в нем клейковине, утративших связь

спочвой и колосом, процессы динамического изменения со- става и физических свойств клейковины, начавшиеся еще в зерне, созревающем на корню продолжаются во время нахож- дения в валках, при хранении на хлебоприемном предприя- тии в период его дозревания и дальнейшем хранении.

Большие изменения состава, состояния и качества клей- ковины происходят при переработке зерна в муку и крупу и осо- бенно глубокие при тестоведении, главным образом под воздей- ствием разнообразных ферментов. Отличительная особенность накопления огромных научно-экспериментальных материалов по составу и строению клейковины — постоянная противоречи- вость, лишающая возможности выявить общее в них, что позво-

лило бы выбрать конкретные пути регулирования и улучшения ее технологических свойств. Существуют изначальные законо- мерности формирования зерна и клейковины, их состава, струк- туры и свойств, объединяющих трудно улавливаемые природные безграничные противоречивые варьирования. В них заложены базовые причины неудач исследований проблемы клейковины, имеющей огромную практическую значимость.

Первая причина. Формирование зерна и клейковины, их состава, структуры и свойств определяется взаимодействи- ем генотипа и внешних условий выращивания зерна (поч- венно-климатических, агротехнических), составляющим его

98

_________________________________________БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

фенотип*. Как показал выдающийся естествоиспытатель Н. И. Вавилов, на благоприятном агрофоне первостепенное значение имеет генотип, а на скудном агрофоне — внешние условия выращивания зерна.

Вторая причина. Составляющие зерно вещества находятся во взаимной связи, состоянии динамического обмена. Изме-

нение каждого из них влечет за собой ответное изменение группы других, в целом онтогенеза и качества зерна.

Третья причина. Вода — среда и активный участник всех жиз- ненных процессов в зерне. Тотальное значение воды заключа- ется в том, что ее количество и уровень энергии связи с сухим

субстратом в сочетании с температурой определяют активные ферментные системы — движущие силы абсолютного большин- ства процессов в зерне. Вода выполняет роль пускового меха- низма ферментов и регулятора интенсивности их действия.

Сложный химический состав зерна, огромное разнообразие биологически скоординированных во времени, пространстве и последовательности непрерывно протекающих в нем с различ- ной интенсивностью физико-химических и биохимических

процессов составляют неустойчивую основу его технологического качества — мукомольного и хлебопекарного. Поиск

совершенного способа оценки технологического качества клейковины, мукомольного и хлебопекарного достоинства пшеничного зерна и муки лежит на путях компьютеризации. Выявление взаимных связей, решающих фактор качества зерна и муки, а также математическое их описание, дополненное

экспертными оценками самых знающих и умелых специалистов, заложенные в компьютер, дадут безошибочную

и интегральную их технологическую оценку в любом сочетании исходных данных.

Для компьютерной оценки качества зерна пшеницы не по одной клейковине, а по количеству признаков уже имеются реальные предпосылки. Многое сделано в этой области за ру- не жом. Требуется расширить работы отечественных ученых по компьютеризации оценки качества зерна.

* Фенотип — совокупность всех признаков и свойств особи (каждого растения), формирующихся в процессе взаимодействия ее генотипа и внеш- ней среды.

ГЛАВА 2_____________________________________________________________

§ 15. КЛЕЙКОВИНА И ФЕРМЕНТЫ

Начальная биологическая единица — клетка и отдельная молекула биологического вещества обладают компьютерны- ми свойствами. В ходе ферментативной реакции за время око- ло 100 мкс молекула фермента распознает среди большого чис-

ла окружающих ее молекул различных веществ определенный объект — молекулу субстрата, присоединяет ее, превращая в продукт, или высвобождая из субстрата. Не может быть в сто- роне от формирования клейковины ферментная система зер- на. Клейковинный комплекс и его агрегирование происходит в ходе синтеза всех других веществ зерна: клейковинообразую- щие белки не могут ждать, когда их будут отмывать. Сама клей- ковина обладает ферментативной активностью. В клейковине экспериментально установлена активность протеаз, б-амила- зы, о-дифенолоксидазы (монофенол-монооксигеназы), ката- лазы. Установлена большая роль дисульфидных связей (—S— S—) и сульфгидрильных групп (—SH) в структуре и свойствах клейковины. Обе эти химические группы включены в фермен- тативный тиол* — дисульфидный обмен, который представ- ляет собой сложную совокупность последовательных окисли- тельно-восстановительных превращений, происходящих с участием дисульфидных связей и SH — групп белковых моле- кул и низкомолекулярных соединений.

Вконце XX столетия в Сибирским институте физиологии

ибиохимии растений выполнено исследование, выдвинувшее

концепцию формирования белкового комплекса клейковины пшеницы, основанной на регуляторной функции ферментов тиол-дисульфидного обмена. Показано, что в развивающихся зерновках функционирует специализированная система фер- ментов, катализирующая образование дисульфидных связей в белках (тиол: кислородредуктаза), их диссоциацию (тиол: про- теин-дисульфидоксиредуктаза) и перегруппировку (тиол: про- теин-дисульфидизомераза). Как установлено ранее выполнен- ными работами с высокой активностью в тиол:дисульфидном обмене клейковины принимает участие трипептид глютати-

* Ти... — приставка в названии сернистых аналогов кислородсодержащих соединений.

100

________________________________________ БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

он, состоящий из остатков гликокола, цистеина и глютамино- вой кислоты:

Глютатион содержится во всех живых клетках. Его содер- жание особенно высоко в зародыше пшеничного зерна и дрож- жах. Чрезвычайно важная роль глютатиона заключается в том, что он является сильным восстановителем и очень легко под- вергается окислению, подобно цистеину. При этом так же, как И и цистеине, окисляется сульфгидрильная группа —SH (от- нимается водород) и две молекулы восстановленного глюта- тиона соединяются дисульфидной связью, образуя молекулу окисленного глютатиона:

Взаимопревращение окисленной и восстановленной форм глютатиона катализируется группой ферментов приведенных выше. Глютатион оказывает большое влияние на активность Ферментов, особенно тех, действие которых связано с превра- щениями белков. Окисленный глютатион изображают сокра- щенно Г—S—S—Г, восстановленный —Г—SH.

Свойства белков созревающего и прорастающего зерна связаны с содержанием —S—S— связей и — SH-гpyпп. При хорошем качестве клейковины соотношение Г—S—S—Г/Г— SH высокое. При прорастании зерна дисульфидные связи распа-