Материал: Biokhimia_v_risunkakh

ДНК-лигаза

  1 - топоизомераза (гираза) - обратимая нуклеаза, сначала она разрывает цепь ДНК, а по окончании репликации зашивает временные надрезы, раскручивает суперспирализованную ДНК и выполняет “шарнирную” функцию - препятствует вращению суперспирализованной цепи (вносит одноцепочечные разрывы в цепь ДНК и тут же ее репарирует)

  2 - хеликаза - использует энергию АТФ для расплетения двойной спирали ДНК, разрывает водородные связи между комплиментарными нуклеотидами в двойной цепи ДНК (застежка “молния”)

  3 - ДНК-зависимая РНК-полимераза (праймаза) - синтезирует РНК-праймер -

олигорибонуклеотид, служащий затравкой для ДНК-полимеразы III

  4 - ДНКполимераза I (фермент Корнберга) - расщепляет праймер (обладает нуклеазной активностью) и на его месте синтезирует комплиментарную цепь ДНК (обладает полимеразной активностью), заполняет бреши.

  5 - ДНК-полимераза III -основной фермент репликации - синтезирует комплиментарные дочерние цепи на разошедшихся материнских цепях в направлении 5’ 3’. Она не способна инициировать синтез новой цепи ДНК, может лишь удлинять затравку-праймер. Образует 3,5-фосфоэфирные связи между нуклеотидами, используя в качестве субстратов нуклеозидтрифосфаты (НТФ).

  6 - ДНК-лигаза сшивает фрагменты синтезированной дочерней ДНК.

125

В настоящее время процесс репликации у прокариот достаточно изучен, в то время как многие аспекты эукариотической репликации остаются неясными. Однако, с большой долей вероятности можно утверждать, что в большинстве клеток этот процесс протекает в основном одинаково.

ЭТАПЫ РЕПЛИКАЦИИ

Движение хеликазы усиливает скрученность (супер-спирализацию) впереди нее. Убирают образующиеся супервитки ферменты топоизомеразы. Они разрывают фосфатную перемычку (3’ – 5’ – cвязь) в одной из цепей (не гидролизуя, а замыкая 3- фосфоэфирную связь с д-рибозы на ОН-тирозина фермента). Оставшийся свободный конец свободно вращается, благодаря чему и убираются супервитки, а потом опять сшивается ферментом топоизомеразой.

Как уже отмечалось, ДНК-полимеразы не могут соединять 2 первых нуклеотида, т.е. инициировать синтез, они могут только удлинять цепь. Поэтому в начале белок DnaG (праймаза) присоединяется к открытым цепям ДНК в области ori и катализирует синтез затравки – праймера (10-12 нуклеотидов РНК, присоединенные по принципу комплиментарности). Праймаза образует связи 3’ – 5’. Синтез происходит в

После завершения синтеза праймера дальнейший рост осуществляет основной фермент репликации - ДНК-полимераза III.

Как лидирующая цепь, так и отстающая, (из фрагментов Оказаки) синтезируются ДНКполимеразой III. Кроме полимеразной активности, все ДНК-полимеразы обладают и 3’, 5’-экзонуклеазной активностью, т.е. могут гидролизировать связь и удалять нуклетиды с 3’-концов (в направлении «назад»), что позволяет этим ферментам проверять и устранять свои ошибки.

У полимераз I и III есть и 5’3’ экзонуклеазная активность, что позволяет им участвовать в репарации.

Та же активность позволяет ДНК-полимеразе I удалять праймер, постепенно отрезая от 5’-конца по одному рибонуклеотиду, а к 3 ’-концу фрагмента присоединяя

Редактирующая активность ДНК-полимеразы III

Если к растущей цепи добавился неправильный нуклеотид, он немедленно удаляется еще до завершения синтеза. При образовании неправильной пары резко ухудшается кинетика процесса, скорость движения фермента падает, в результате активируется другой центр ДНК-полимеразы III, который гидролизует (удаляет) последний ошибочный нуклеотид (фермент как бы «оглядывается» и исправляет свою ошибку!)

Ошибки возникают с частотой примерно одна на миллион Редактирующая активность фермента понижает частоту ошибок в ~100 раз.

3. Терминация.

Заканчивается репликация тогда, когда вся матричная ДНК скопирована. В образованной таким образом двойной спирали ДНК только одна из цепей синтезирована заново. Поэтому говорят, что репликация ДНК происходит по

полуконсервативному механизму . У E.coli петля растет со скоростью 1000 пар нуклеотидов в секунду. Для репликации всей молекулы хромосомной ДНК этой бактерии необходимо 42 минуты. У эукариот репликативная петля растет со скоростью 100 п.н. в секунду. Вероятно, это связано с наличием связи с гистонами. У человека для полной дупликации ДНК необходимо 8 часов.

Принципы репликации:

  комплементарность   антипараллельность   униполярность

  потребность в затравке   прерывистость   полуконсервативность

128

«Молекулярные часы клетки» - теломеры

Особенность репликации линейных молекул эукариот связана со сложностью репликации концевых участков матрицы ДНК: отстающая цепь репликации не может синтезироваться до 5’ конца без праймера, а он не образуется на самом концевом участке. Потери концевой ДНК делают невозможным бесконечное деление клеток.

Считается, что существуют «молекулярные часы», определяющие продолжительность жизни соматических клеток. Обнаружено, что концы линейных хромосом защищены специальными последовательностями TTGGGG, которые повторяются тысячи раз. Они называются теломерами. Без них хромосомы начинают сливаться с большой частотой, что вызывает генетические нарушения.

Наличие на концах хромосом специальной теломерной ДНК позволяет решить и проблему концевой недорепликации.

Соматические клетки теряют от 50 до 200 п.о. при каждом делении клетки, что является основой молекулярного механизма, определяющего продолжительность жизни клетки.

«Бессмертные клетки» (бесконечно пролиферирующие) содержат фермент теломеразу, которая достраивает свободные 3’ концы хромосом короткими повторяющимися последовательностями – теломерами. Теломераза содержит собственную РНК-матрицу, поэтому она относится к обратным транскриптазам. Используя эту матрицу, теломераза удлиняет молекулу ДНК, которая затем реплицируется с помощью ДНКполимеразы.

В большинстве клеток теломераза заблокирована, она активна в стволовых и половых клетках.

В каждом цикле деления полимеры клетки укорачиваются из-за «недорепликации» - важнейшего фактора биологического строения. Теломера укорачивается медленно: по 3-6-нуклеотидов за клеточный цикл. Но эта эрозия может ускоряться в сотни раз рекомбинаций в их ДНК.

Предполагается, что ингибиторы обратных транскриптаз (азидотимидин, карбовир), могут подавлять работу теломеразы в клетке, вызывая процесс, похожий на старение клеток in vitro, что проявляется прекращением пролиферации и специфическом изменении морфологии клеток.

129