Материал: vse_metody_MIKROB

Реакция нейтрализации (РН) в культуре клеток: 2-компонентная,

сложная серологическая реакция.

Компоненты реакции: исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг), типо-

вые противовирусные диагностические сыворотки (Ат).

Индикатор реакции: культура клеток.

Постановка реакции: вируссодержащую жидкость смешивают в пробирках со специфическими диагностическими сыворотками. Оставляют на 1 час при комнатной температуре. Затем содержимым пробирок заражают культуры кле-

ток во флаконах.

Положительная реакция: тип вируса соответствует типу сыворотки. Про-

исходит нейтрализация вируса антителами сыворотки и культура клеток оста-

ется нормальной, без изменений.

Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки. Ви-

рус оказывает цитопатогенное действие, что приводит к дегенерации культу-

ры клеток.

РН в культуре клеток применяют для идентификации вирусов полиомие-

лита, аденовирусов и др.

РН можно также использовать для идентификации вирусов, культи-

вируемых в организме лабораторных животных. Компоненты и постановка реакции такие же, как в РН в культуре клеток. Индикатор реакции: лаборатор-

ное животное (в частности, белые мыши).

Положительная реакция: тип вируса соответствует типу диагностической сыворотки, происходит его нейтрализация антителами сыворотки и животное

остается здоровым.

Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки, жи-

вотное погибает.

РН в организме животного используется для идентификации вирусов бе-

шенства.

В таблице 2 представлены обобщенные данные о методах культивирова-

ния, индикации и идентификации вирусов.

4

Таблица 2 – Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов

2. Интерфероны, классификация, механизм действия, практическое при-

менение

Интерфероны – гликопротеины, которые вырабатываются многими клет-

ками организма. Однако эта способность наиболее выражена у лейкоцитов,

фибробластов и лимфоцитов. Интерфероны (ИФ) являются цитокинами, подав-

ляющими размножение вирусов, определенных бактерий и некоторых раковых клеток.

По природе клеток, вырабатывающих ИФ, их делят на три группы: α-ИФ (лейкоцитарный): обладает выраженным противовирусным дейст-

вием;

β-ИФ (фибробластный): обладает противовирусным действием, а также регулирует работу лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (иммуномо-

дулирующее действие);

γ-ИФ (иммунный): продуцируется всеми Т-лимфоцитами, стимулирует активность Т- и В-лимфоцитов, фагоцитов, усиливает синтез молекул MHCI и

MHCII и др. Таким образом, γ-ИФ усиливает активность всех звеньев им-

мунной системы.

Механизм противовирусного действия интерферонов.

Интерфероны ингибируют внутриклеточную репликацию широкого спек-

тра ДНК- и РНК-содержащих вирусов.

Винфицированной клетке синтезируется ИФ, выходит из нее, связывается

споверхностью здоровой клетки и индуцирует в ней синтез антивирусных бел-

ков. Если в эту клетку проникает вирус, то его репродукция подавляется этими

белками. Один из них является ферментом рибонуклеазой, которая разрушает

5

мРНК вируса. Второй фермент – протеинкиназа – блокирует синтез вирусных белков. Репродукция вируса становится невозможной.

Практическое использование интерферона для лечения и профилактики вирусных инфекций связано с использованием препаратов на основе генно-

инженерного рекомбинантного α2-ИФ. Его получают в культуре бактерий по-

сле встраивания в их геном гена человеческого α-ИФ. Рекомбинантный α2-ИФ эффективен для лечения хронических гепатитов В и С, герпетической и папил-

ломавирусной инфекции.

3. Особенности противовирусного иммунитета.

Интерфероны (гликопротеины) продуцируются клетками при вирусной ин-

фекции. Являются первой, наиболее ранней линией защиты (через несколько часов после начала размножения вируса).

Основными клетками, осуществляющими в организме противовирусный им-

мунологический надзор, являются ЦТЛ и NK-клетки. Они разрушают инфи-

цированные вирусом клетки с помощью перфоринов и гранзимов.

Т-лимфоциты и интерфероны приводят организм к выздоровлению, но не формируют приобретенного иммунитета.

Противовирусные антитела (секреторные IgA и сывороточные IgM и G) за-

щищают только при внеклеточном расположении вирусов. Окружая вирио-

ны, они препятствуют их адсорбции на клетке.

Гуморальное звено защиты формирует приобретенный (постинфекцион-

ный) иммунитет за счет клонов клеток памяти из В-лимфоцитов.

Развитие вирусной инфекции всегда подавляет некоторые защитные меха-

низмы (незавершенность фагоцитоза, подавление синтеза молекул MHC I

класса на поверхности зараженных клеток, подавление активации компле-

мента по классическому и альтернативному пути и т.д.).

6

Практическая работа

1. Вирусологический метод диагностики (продолжение).

а) индикация и идентификация вируса гриппа в аллантоисной жидкости

куриного эмбриона.

II этап исследования: вскрытие куриных эмбрионов, взятие вируссодер-

жащей аллантоисной жидкости.

Скорлупу над воздушной камерой дезинфицируют, стерильными ножни-

цами срезают ее на 2-3 мм выше границы воздушной камеры. Через прокол в хорионаллантоисной оболочке стерильной пастеровской пипеткой набирают вируссодержащую аллантоисную жидкость в количестве 3-4 мл в стерильную пробирку. Индикацию вируса гриппа в аллантоисной жидкости проводят в ре-

акции гемагглютинации (РГА) (таблица 3).

Таблица 3 – Индикация и определение титра вируса гриппа в РГА

Затем проводят идентификацию вируса гриппа в РТГА (таблица 4).

7

Таблица 4 – Идентификация вируса гриппа в РТГА

Контакт 30-40 минут при комнатной температуре

1% куриные 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

эритроциты (мл)

Как видно из таблицы 4, вначале наливают по 0,25 мл физ. раствора во 2, 3, 4, 5 и 6 лунки полистироловой пластины, а в 8-ю лунку – 0,5 мл. Затем готовят двукратные разведения типовых гриппозных диагностических сывороток до разведения 1/320. К этим разведениям добавляют вируссодержащую жидкость в объеме 0,25 мл и смеси оставляют для контакта на 30-40 минут при комнатной температуре. После этого во все лунки вносят по 0,5мл 1% взвеси куриных эритроцитов.

Контроли реакции: контроль сыворотки (0,5мл сыворотки + 0,5мл эритроцитов) и контроль эритроцитов (0,5мл физ. раствора + 0,5мл эритроцитов).

Учет реакции через 1-2 часа (таблица 5).

Таблица 5 – Схема учета РТГА

Заключение о типе вируса сделайте самостоятельно.

б) индикация и индентификация вирусов, культивируемых в культуре клеток Нер-2.

8