Материал: vse_metody_MIKROB

III этап исследования: учет цитопатогенного действия (ЦПД) исследуемого вируса на культуру клеток Нер-2.

Под малым увеличением микроскопа отмечают дегенерацию клеток, свидетельствующую о размножении вирусов. Монослой разрушен, оставшиеся клетки округлые, без отростков, с темной зернистой цитоплазмой.

С целью идентификации вирусов производят постановку реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток с аденовирусными диагностическими сыворотками к вирусам 3, 4 и 7 типов, т.к. они наиболее часто вызывают заболевания у людей.

Для постановки РН в три пробирки стерильной пипеткой вносят аденовирусные диагностические сыворотки 3, 4, 7 типов в объеме 0,2 мл. К каждой из этих сывороток добавляют другой стерильной пипеткой по 0,2 мл исследуемой вируссодержащей жидкости. Смеси оставляют для контакта на 1 час, затем каждой смесью в объеме 0,2 мл заражают флаконы с культурой клеток и добавляют по 0,8 мл среды 199.

Контроли реакции: контроль культуры клеток; контроль сывороток (культура клеток + смесь сывороток 3, 4, 7 типов); контроль вируса (культура клеток + вируссодержащая жидкость). Все флаконы (опытные и контрольные) помещают в термостат при температуре 370С на 48-72 часа.

IV этап исследования: учет РН в культуре клеток (таблица 6).

Таблица 6 – Схема учета РН в культуре клеток

Вконтроле культуры клеток и контроле смеси сывороток – монослой из нормальных клеток, т.е. отсутствует дегенерация.

Вконтроле вируса – дегенерация клеток за счет цитопатогенного действия исследуемого вируса.

Вопытных флаконах монослой из нормальных клеток остается в том флаконе, где произошла нейтрализация вируса, т.е. тип сыворотки совпал с типом инфицирующего агента.

Заключение о типе вируса сделайте самостоятельно.

9

Занятие №15

Тема. Бактериофаги. Генетика и изменчивость бактерий. Антибиотики.

Цель занятия. Изучить свойства бактериофагов, их практическое применение,

генетику и изменчивость бактерий, характеристику и спектр действия антибио-

тиков. Освоить методы определения чувствительности бактерий к антибиоти-

кам.

I.Теоретические знания:

1.Морфология и структура бактериофагов, их классификация.

2.Вирулентные и умеренные бактериофаги. Фазы взаимодействия вирулентно-

го бактериофага с клеткой. Практическое применение бактериофагов.

3.Организация генетического материала бактериальной клетки. Факторы вне-

хромосомной наследственности.

4.Виды генетической изменчивости. Использование генной инженерии в меди-

цине.

5.Антибиотики. Классификация антибиотиков по механизму антимикробного действия.

6.Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Осложне-

ния и последствия антибиотикотерапии.

II.Практические навыки:

1.Определение фаготипа бактерий.

2.Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений.

3.Определение чувствительности бактерий к антибиотикам диско-

диффузионным методом.

1

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1. Морфология и структура бактериофагов, их классификация.

Бактериофаги (от греч. bacterion – бактерии, phagos – пожирающий) –

вирусы бактерий, вызывающие их гибель.

Бактериофаги были открыты в 1917 г. канадским ученым Ф. Д'Эррелем. Исследователь выделил из испражнений больных дизентерией фильтрую-

щийся агент, способный разрушать, лизировать дизентерийные бактерии. Последующие наблю-

дения показали, что бактериофаги встречаются повсеместно, где есть бактерии: в почве, сточных Ф. Д'Эррель водах, кишечном тракте человека и животных, гнойном отделяемом и других субстратах. По-

этому в широком смысле слова их часто называ-

ют просто фагами.

В зависимости от формы и структурной организации фаги подразделяют на пять морфологических групп (классификация А.С. Тихоненко) (рисунок 6):

I. Фаги I типа – нитевидной формы.

II. Фаги II типа – имеют головку и рудимент отростка.

III. Фаги III типа – имеют головку с коротким отростком.

IV. Фаги IV типа – имеют головку и длинный несокращающийся отросток.

V.Фаги V типа – имеют головку и длинный сокращающийся отросток.

Рисунок 6 – Морфологическая классификация бактериофагов по А.С.Тихоненко

2

Самое сложное строение у фагов V группы.

Структура сложноустроенного фага (рисунок 7):

-головка, в которой содержится нуклеиновая кислота;

-воротничковая часть;

-отросток, сверху покрытый сократительным чехлом. На конце отростка находятся базальная пластинка и нити прикрепления для адсорбции фага на бактериальной клетке.

Оболочечные структуры фага имеют белковую природу.

воротничковая часть

базальная

пластинка

нити

прикрепления

Рисунок 7 – Структура сложноустроенного фага

2.Вирулентные и умеренные бактериофаги. Фазы взаимодействия виру-

лентного бактериофага с клеткой. Практическое применение бактерио-

фагов.

В зависимости от характера взаимодействия с бактериальной клеткой, раз-

личают вирулентные и умеренные бактериофаги.

Вирулентные фаги способны вызывать взрывную продуктивную инфек-

цию. Проникнув в бактериальные клетки, они размножаются и вызывают лизис бактерий. Умеренные фаги чаще вызывают интегративную вирусную инфек-

цию, которая может переходить в продуктивную.

3

Фазы взаимодействия сложноустроенного вирулентного бактериофага

с клеткой:

Адсорбция (отростковой частью фага) на клеточной стенке бактерий. В эту фазу рецепторы базальной пластинки и нитей прикрепления специфически взаимодействуют с определенными рецепторами клеточной стенки бактерий.

На бактериях, лишенных клеточной стенки (L-формы, микоплазмы), фаги не адсорбируются.

Проникновение нуклеиновой кислоты фага в клетку: происходит сокра-

щение чехла отростка и растворение с помощью фагового лизоцима неболь-

шого участка клеточной стенки бактерии. Затем ДНК из головки бактериофа-

га через канал отростка инъецируется (впрыскивается) в цитоплазму клетки,

при этом оболочка фага остается на поверхности бактериальной клетки.

Синтез фаговых частиц (подобно синтезу вирусов в эукариотической клет-

ке): происходит репликация нуклеиновой кислоты бактериофага с образова-

нием множества копий, а на рибосомах бактериальной клетки – синтез фаго-

вых белков головки и отростка.

Композиция фаговых частиц: происходит сборка белковых оболочек и нуклеиновых кислот и формируются зрелые бактериофаги.

Выход фагов из бактериальной клетки путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется за счет свободного лизоцима, выделяемого множеством фа-

гов, что приводит к гибели бактерий в результате ее осмотического лизиса.

Репродукция вирулентного фага в популяции бактерий, выращенных в жидкой питательной среде (МПБ), сопровождается их лизисом и просветлени-

ем среды (рисунок 8а). В популяции чувствительных бактерий, выращенных сплошным газоном на плотной питательной среде (МПА), фаги образуют зоны очагового лизиса (рисунок 8б), которые называются «негативными колониями» или стерильными бляшками.

4