Материал: vse_metody_MIKROB

тител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностически значи-

мой является сероконверсия для взрослых в 4 раза, а для детей – в 2 раза.

Практическая работа

1. Изучение под микроскопом готовых препаратов включений Бабеша-

Негри (окраска по Селлерсу). Краситель Селлерса состоит из 2-х частей 1%

раствора метиленовой сини в метиловом спирте и 1 части 1% раствора основ-

ного фуксина в метиловом спирте. Этот краситель наносят на 1-5 секунд на влажный, нефиксированный мазок-отпечаток из ткани мозга, чаще из области гиппокампа (аммонова рога) человека или животного, погибшего от бешенства.

При световой микроскопии с иммерсионной системой на голубом фоне цито-

плазмы нейронов видны ярко-красные включения Бабеша-Негри. Включения четко контурированы, имеют овальную или продолговатую форму и зернистую структуру.

2. Вирусологический метод диагностики.

а) культивирование вирусов в курином эмбрионе.

I этап исследования: заражение куриных эмбрионов в аллантоисную по-

лость материалом от больного с подозрением на гриппозную инфекцию.

С помощью овоскопа определяют расположение и границы воздушной ка-

меры (отметить карандашом). Скорлупу яйца в области воздушной камеры об-

рабатывают спиртовым раствором йода. Пробойником делают отверстие в цен-

тре камеры, затем шприцем вводят вируссодержащую жидкость в количестве

0,1-0,2 мл в аллантоисную полость. Отверстие парафинируют. Зараженные эм-

брионы помещают в термостат при 370С на 48 часов.

б) культивирование вирусов в культуре клеток Нер-2.

I этап исследования: приготовление перевиваемой культуры клеток Нер-2.

Для получения монослоя культуры клеток количество клеток во взвеси подсчитывают в камере Горяева. Взвесь клеток разводят средой 199 до количе-

ства 100 тысяч клеток в 1мл. В стерильный пенициллиновый флакон вносят стерильной пипеткой над пламенем спиртовки 1мл взвеси клеток в питательной

13

среде 199, закрывают флакон стерильной резиновой пробкой. На флаконе ка-

рандашом по стеклу проводят продольную черту. Затем помещают флакон в специальный штатив в горизонтальном положении, чертой кверху, и ставят в термостат при 370С на 3-5 дней для получения монослоя клеток на стенке фла-

кона.

II этап исследования:

 микроскопический контроль выросшей культуры клеток Нер-2. Под ма-

лым увеличением микроскопа просматривают культуру клеток. Для заражения отбирают флаконы с полноценным монослоем (видны прозрачные, блестящие клетки, имеющие отростки, прикрепленные к стеклу);

 заражение культуры клеток смывом из носоглотки больного с подозре-

нием на аденовирусную инфекцию. Во флакон с полноценным монослоем кле-

ток над пламенем спиртовки вносят стерильной пипеткой вируссодержащую жидкость в объеме 0,1мл. Затем второй стерильной пипеткой добавляют во флакон 0,9мл среды 199 с бычьей сывороткой. Флаконы с зараженной культу-

рой клеток укладывают в штатив и ставят в термостат при 370С на 48-72 часа.

14

Занятие №2

Тема. Вирусологический метод диагностики. Интерфероны, классификация,

механизм действия, практическое применение. Особенности противовирусного иммунитета.

Цель занятия. Освоить принципы индикации и идентификации вирусов.

Изучить особенности противовирусного иммунитета.

I.Теоретические знания:

1.Вирусологический метод диагностики. Методы индикации и идентификации вирусов.

2.Интерфероны, классификация. Механизм действия. Практическое примене-

ние.

3.Особенности противовирусного иммунитета

II.Практические навыки:

1.Провести вскрытие куриного эмбриона и взятие вируссодержащей алланто-

исной жидкости.

2.Определить наличие вируса гриппа в аллантоисной жидкости куриного эм-

бриона с помощью реакции гемагглютинации.

3.Провести идентификацию вируса гриппа в реакции торможения гемагглюти-

нации.

4.Провести учет цитопатогенного действия аденовирусов на культуру клеток.

5.Провести идентификацию аденовирусов с помощью реакции нейтрализации

вкультуре клеток.

1

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1.Вирусологический метод диагностики. Методы индикации и идентифи-

кации вирусов.

Методы индикации вирусов

Индикацию (обнаружение) вирусов в материале от больного проводят

различными способами. Они зависят от метода культивирования вируса:

Если вирус способен размножаться в курином эмбрионе, то для его обна-

ружения используют реакцию гемагглютинации (РГА). Она основана на спо-

собности таких вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты с помощью фермента «гемагглютинина», расположенного в суперкапсиде вируса. В ре-

зультате реакции in vitro наблюдается осадок эритроцитов в виде «перевернуто-

го зонтика» – это положительный результат РГА. При отрицательной реакции – выпадает осадок эритроцитов с ровными краями. Используют для индикации

вирусов гриппа.

Индикацию вирусов, культивируемых в культуре клеток, можно прово-

дить по их цитопатогенному действию (ЦПД) на клетки (рисунок 5). Это дей-

ствие выражается в повреждении монослоя зараженной культуры клеток и из-

менении их морфологии: клетки округляются, темнеют, теряют отростки, в них появляется зернистость. Эти изменения обозначают термином «дегенерация клеток». В дальнейшем происходит отслойка клеток от стекла – нарушение

монослоя. Используют для индикации аденовирусов. а) б)

Рисунок 5 – Культура клеток: нормальная (а), дегенерированная (б)

2

Индикацию вирусов, культивируемых в организме лабораторных живот-

ных, проводят по факту гибели животного. Используют для индикации вируса бешенства.

Методы идентификации вирусов

Идентификацию вирусов проводят по антигенным свойствам с помощью серологических реакций со специфическими диагностическими противовирус-

ными сыворотками. Основными реакциями являются: реакция торможения ге-

магглютинации, реакция нейтрализации в культуре клеток или в организме жи-

вотного, реакция иммунофлюоресценции (РИФ) и иммуноферментный анализ

(ИФА).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА): 2-компонентная, слож-

ная серологическая реакция.

Компоненты реакции: исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг), типо-

вые противовирусные диагностические сыворотки (Ат).

Индикатор реакции: 1% взвесь эритроцитов.

Постановка реакции: готовят разведения диагностических сывороток в лунках полистироловой пластины. К ним добавляют вируссодержащую жид-

кость и оставляют на 30-40 минут при комнатной температуре. Затем в лунки вносят взвесь эритроцитов. Учет реакции проводят через 1-2 часа.

Положительная реакция: тип вируса соответствует типу сыворотки. Ви-

русный гемагглютинин блокируется антителами сыворотки, поэтому агглюти-

нация эритроцитов отсутствует. Визуально в лунках определяется осадок

эритроцитов с ровными краями, в виде «пуговицы».

Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки. Ви-

русный гемагглютинин склеивает эритроциты. Визуально в лунках определяет-

ся осадок эритроцитов с неровными краями в виде «перевернутого зонти-

ка».

РТГА применяют для идентификации вирусов гриппа и других вирусов,

имеющих в суперкапсидной оболочке фермент гемагглютинин.

3