Материал: Тец руководство

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Является основным ме­тодом лабораторной диагностики проказы, так как M.leprae на питательных средах не культивируется. В мазках, приготовлен­ных из материала и окрашенных по методу Циля—Нильсена, микобактерии располагаются скоплениями в виде пачек сигар или наподобие шаров.

Кожно-аллергическая проба (реакция Мицуды) ставится с лепромином. Учитывают реакцию через 24—48 ч по образова­нию инфильтрата на месте введения. Аллергическая реакция диагностического значения не имеет и применяется для харак­теристики клинического течения болезни.

• Микробиологическая диагностика актиномикоза

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: биоптаты ткани и пунктаты из глубоких очагов поражения, гнойное отделяемое^ экссудат, мокрота, промывные воды бронхов, моча.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Подозрительные плот­ные комочки из патологического материала переносят на пред­метные стекла в каплю 10—20 % раствора гидрокарбоната на­трия, слегка подогревают и готовят препарат "раздавленная" капля, который исследуют под микроскопом с объективами 8х и 40х. В положительном случае в препарате обнаруживают актиномицеты в виде друз — характерных зернистых образова­ний с плотным гиалиновым центром, окруженным лучистыми нитевидными клетками. Наряду с друзами встречаются отдель­ные грамположительные неравномерно окрашивающиеся вет­вистые бактерии (см. рис. 2.3.1). Друзы также могут быть обнаружены в гистологических срезах биоптатов органов, ок­рашенных стандартными (гематоксилин-эозин) или специаль­ными (окраска Брауна—Брена и др.) методами.

Бактериологическое исследование. Материал засевают на не­сколько питательных сред (тиогликолевую среду, кровяной агар, сердечно-мозговой агар, агар Сабуро и др.). Посевы ин­кубируют в анаэробных и аэробных условиях с добавлением 5 % СО₂. Через 18—24 ч на плотных питательных средах обра­зуются микроколонии, а через 1—2 нед — зрелые колонии. Характерным признаком является "паукообразная" структура микроколонии с многочисленными ветвящимися нитями по периферии. Зрелые колонии могут быть плоскими, морщинис­тыми, бугристыми или пленчатыми. Характер колонии и мор­фология клеток во многих случаях позволяет отнести иссле­дуемую культуру к роду Actinomyces. Окончательная идентифи­кация культуры до вида проводится на основании биохими­ческих и антигенных свойств. Для идентификации используют также методы ГЖХ.

244

Экспресс-методы диагностики. Иммунохимические ис­следования. Метод ИФ: для обнаружения возбудителя в па­тологическом материале фиксированные мазки обрабатывают специфическими флюоресцирующими антителами к антигенам актиномицетов. Свечение бактерий в образце свидетельствует о положительном результате.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз. Метаболиты возбудителя могут быть обнаружены в материале методом ГЖХ.

Серодиагностика. Ставится РСК с сывороткой крови боль­ного и антигеном, представляющим собой поливалентный ак-тинолизат. Положительная реакция наблюдается у 80 % боль­ных людей.

Кожно-аллергическая проба. Ставится с экстрактом из акти­номицетов.

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Туберкулин сухой очищенный (PPD). Получен из фильтрата бульонной культуры микобактерий путем добавления химичес­ких веществ, осаждающих белок, с последующей очисткой и лиофилизацией. Применяют для постановки кожно-аллерги-ческой пробы.

Вакцина BCG. Живая лиофильно высушенная культура ави-рулентного штамма M.bovis BCG, полученного французскими учеными Кальметтом и Гереном. Применяется внутрикожно для активной специфической профилактики туберкулеза.

Лепромин. Гомогенизированная взвесь лепрозного узелка, инактивированного нагреванием. Применяют для постановки кожно-аллергической пробы при лепре.

Актинолизат. Фильтрат бульонной культуры спонтанно ли-зированных штаммов актиномицетов. Применяют для специ­фической иммунотерапии и в качестве антигена для постанов­ки РСК.

Актиномицетная поливалентная убитая вакцина. Готовится из спороносных штаммов актиномицетов. Применяют с лечебной целью.

Антибиотики. Для лечения туберкулеза: стрептоми­цин, ПАСК, производные ГИНК (тубазид, фтивазид, метазид и др.), этионамид, этамбутол, пиразинамид, рифампицин, цик-лосерин, канамицин, фторхинолоны и др. Обычно используют комбинации препаратов (не менее трех препаратов различных групп) с учетом чувствительности М.tuberculosis и клинической характеристики заболевания.

245

ражением других органов возможен для вирусов иммунодефи­цита человека, гепатита В, цитомегаловирусной инфекции. Мик­робиологическая диагностика урогенитальных инфекций, вы­званных простейшими, грибами и вирусами, излагается в со­ответствующих главах Руководства.

Тема 15.1. ВОЗБУДИТЕЛИ СИФИЛИСА И МЯГКОГО ШАНКРА

План

Программа

Биологические свойства возбудителей сифилиса и мягкого шанкра, их патогенность, экология, особен­ности инфекции и эпидемиология вызываемых забо­леваний.

Микробиологическая диагностика.

Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

а Демонстрация

Treponema pallidum — мазок из отделяемого твердого шанкра, окраска T.pallidum методом серебрения (или микрофотография в темном поле).

Haemophilus ducreyi — мазок из отделяемого мягкого шанкра, окраска по методу Грама и метиленовым си­ним.

Диагностические и лечебные препараты.

Задание студентам

Указать материал для исследования.

Зарисовать демонстрируемые препараты возбудителей сифилиса и мягкого шанкра.

Серодиагностика сифилиса:

учесть результаты реакции Вассермана. Сделать за­ключение.

учесть результаты реакции микропреципитации.

Сделать заключение.

оценить результаты реакции иммобилизации трепонем (РИТ). Сделать заключение.

4. Дать краткую характеристику диагностическим и лечебным препаратам.

Методические указания

• Микробиологическая диагностика сифилиса

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: отделяемое шанкра (I период заболевания); аспират из высыпных элементов, пунк-тат регионарных лимфатических узлов (II период); кровь (II, III, IV период); спинномозговая жидкость (IV период заболе­вания).

247

следуемой инактивированной сывороткой крови или плаз­мой. В лунку на пластине из плексигласа (или на обычное стекло) наносят 3 капли сыворотки и добавляют 1 каплю кардиолипинового антигена. Смесь тщательно перемешивают и учитывают результаты. Положительная реакция характеризу­ется образованием и выпадением хлопьев разной величины; при отрицательном результате наблюдается равномерная лег­кая опалесценция. Положительная реакция микропреципита­ции позволяет поставить предварительный диагноз и направить пациента на дальнейшее обследование.

Реакцию Вассермана ставят одновременно с двумя антигенами: 1) специфическим, содержащим антиген возбуди­теля — разрушенные ультразвуком трепонемы; 2) неспецифи­ческим — кардиолипиновым. Исследуемую сыворотку разводят в соотношении 1:5 и ставят РСК по общепринятой методике. При положительной реакции наблюдается задержка гемоли­за, при отрицательной — происходит гемолиз эритроцитов, интенсивность реакции оценивается соответственно от (++++) До (-).

Первый период сифилиса является серонегативным и харак­теризуется отрицательной реакцией Вассермана. У 50 % боль­ных реакция становится положительной не ранее чем через 2—3 нед после появления твердого шанкра. Во II и III периоде сифилиса частота положительных реакций достигает 75—90 %. После успешно проведенного курса лечения реакция Вассер­мана становится отрицательной.

Для диагностики поздних и латентных форм сифилиса мож­но ставить реакцию Вассермана, используя спинномозговую жидкость, с теми же антигенами, что и в реакции с сывороткой больного.

РИФ —реакция непрямой ИФ—является специфи­ческой при диагностике сифилиса. В качестве антигена ис­пользуют взвесь тканевых трепонем. Разработаны разные ме­тодики постановки реакции; обычно используют модифика­цию РИФ-200. Сыворотку больного инактивируют так же, как для реакции Вассермана, и разводят в соотношении 1:200. На предметные стекла наносят каплю антигена, высушивают и фиксируют 5 мин в ацетоне. Затем на препарат наносят сыво­ротку больного, через 30 мин промывают и высушивают. Сле­дующим этапом является обработка препарата флюоресцирую­щей сывороткой против иммуноглобулинов человека. Изучают препарат с помощью люминесцентного микроскопа, отмечая степень свечения трепонем.

Реакция иммобилизации трепонем также являет­ся специфической. Принцип реакции заключается в угнетении движения трепонем (иммобилизация) антителами сыворотки крови пациента в присутствии комплемента. Живую культуру

250

трепонем получают при культивировании в яичке кролика. Яичко зараженного животного измельчают в специальной сре­де, в которой трепонемы сохраняют подвижность. Ставят ре­акцию следующим образом: взвесь тканевых (подвижных) тре­понем смешивают в пробирке с исследуемой сывороткой и добавляют свежий комплемент. В одну контрольную пробирку вместо исследуемой сыворотки добавляют сыворотку здорового человека, в другую — вместо свежего комплемента добавляют инактивированный. После инкубации при 35 °С в анаэробных условиях (анаэростат) из всех пробирок готовят препарат "раз­давленная" капля и в темном поле определяют количество подвижных и неподвижных трепонем. Процент специфически иммобилизированных трепонем определяют по формуле:

Т -Т

Х= \ °хЮО, Ч

где Tfc — число подвижных трепонем в контроле (с инактиви-рованным комплементом), Т₀ -— число подвижных трепонем в опыте (с активным комплементом). Результат реакции считают положительным, если процент иммобилизации выше 50, сла­боположительным — от 31 до 50, сомнительным — от 21 до 30 и отрицательным — ниже 20. Для обнаружения специфических антител к T.pallidum используют и другие серологические ре­акции, в частности РИГА.

Необходимо отметить, что в широкой медицинской прак­тике при обследовании больных и здоровых лиц обычно ис­пользуют реакцию Вассермана и микропреципитации; РИТ, РИФ и другие специфические реакции применяют для уточ­нения диагноза и проводят в специализированных лаборато­риях.

• Микробиологическая диагностика мягкого шанкра

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: отделяемое из язвы (мягкого шанкра).

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование. Проводят путем микро­скопии мазков, окрашенных по методу Грама и метиленовым синим. Наличие в мазках грамотрицательных бактерий, распо­лагающихся в виде длинных цепочек, позволяет подозревать наличие возбудителя — H.ducreyi.

Бактериологическое исследование. Проводят путем выделе­ния чистой культуры возбудителя. Материал засевают на кро­вяной агар или другие среды, содержащие дефибринированную кровь. На этих средах H.ducreyi через 48—72 ч образует мелкие круглые колонии, окруженные зоной гемолиза. Идентифика­цию выделенной культуры проводят по ферментации Сахаров

251

и по способности агглютинироваться сывороткой этого же больного.

Кожно-аллергическая проба. Ставят с антигеном из H.ducreyi для подтверждения диагноза.

• Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты

Антигены для реакции Вассермана:

специфический антиген из тканевых трепонем, разрушенных ультразвуком;

неспецифический кардиолипиновый антиген — высокоочищенный экстракт бычьего сердца, имеющий постоянный химический состав липидов, смешанных в определенной про­
порции с лецитином и холестерином.

Антигены разводят согласно инструкции и используют в рабочих-дозах, указанных на этикетках. Кардиолипиновый ан­тиген используют также и в реакции микропреципитации.