В последнее время широкое применение нашли также различные коммерческие системы культивирования микобакте-рий, использующие как жидкие, так и плотные питательные среды, а также различные высокочувствительные способы автоматизированного контроля роста бактерий на основании их метаболической активности — по потреблению компонентов питательной среды и/или образованию продуктов жизнедеятельности. Это позволяет обнаружить присутствие бактерий значительно раньше появления видимых признаков роста. Для посева используют стандартные емкости, заполненные готовой средой. Определение концентрации соответствующего метаболита в каждой пробе осуществляется непрерывно с помощью радиометрических, флюорометрических, колориметрических, манометрических или других методов в специальной камере для инкубации посевов, регистрируется и анализируется с помощью компьютера. В настоящее время изотопные методы контроля роста вытесняются неизотопными, основанными на различных способах детекции поглощения и выделения газов (О2 и/или СО2) микроорганизмами в ходе активного метаболизма. Использование указанных методов контроля роста позволяет в большинстве случаев существенно ускорить процесс выделения чистой культуры микобактерий. Положительный результат может быть получен уже через 3—5 дней, средний срок составляет 7—14 дней. Однако, учитывая вероятную низкую концентрацию возбудителя в исследуемом материале, максимальный срок инкубации достаточно велик — результат бактериологического исследования считается отрицательным при отсутствии признаков роста в течение 40 дней. В случае регистрации положительного результата культивирование продолжают до тех пор, когда количество бактерий в среде достигает определенной концентрации, необходимой для проведения дальнейшего изучения выделенной чистой культуры — идентификации и определения чувствительности к антимикробным препаратам. Среднее время культивирования составляет 9—20 дней.
Бактериологический метод дает положительный результат при наличии не менее 10—30 жизнеспособных микобактерий в 1 мл исследуемого материала после обогащения. Чувствительность бактериологического метода приближается к 100 %, однако не всегда позволяет однозначно исключить заболевание.
Отрицательный результат в ряде случаев может быть обусловлен очень низким содержанием возбудителя в клиническом образце.
Идентификация чистой культуры. Выделенные чистые культуры микобактерий обычно идентифицируют до вида. Идентификация осуществляется с помощью традиционных методов (на основании фенотипических признаков бактерий — культуральных и биохимических), а также с использованием молекулярно-генетических и химических методов анализа выделенной культуры.
Традиционные методы идентификации основаны на изучении достаточно большого числа признаков, включая скорость роста, морфологию колоний, способность к пигментообразо-ванию, продукции никотиновой кислоты, восстановлению нитратов и теллурита калия, гидролизу твина-80, мочевины (уре-азная активность), пиразинамида до пиразиновой кислоты (пиразинамидазная активность), перекиси водорода при повышенной температуре (термоустойчивая каталазная активность) и некоторых других. На основании этих признаков можно однозначно идентифицировать представителей основных видов Mycobacterium spp., вызывающих заболевания человека. Процедура идентификации по фенотипическим признакам может занимать до 3 нед. Специфичность метода составляет 100%.
Способность исследуемой культуры синтезировать никотиновую кислоту (ниациновая проба Конно) является одним из важных признаков, с помощью которого удается отличить М. tuberculosis, хорошо синтезирующие никотиновую кислоту, от M.bovis, образующих ее в минимальных количествах. Для определения ниацина к культуре микобактерий в жидкой питательной среде добавляют 1 мл раствора KCN и 1 мл 5 % раствора хлорамина. При наличии ниацина через несколько минут появляется ярко-желтая окраска. Для нейтрализации KCN после учета результатов реакции в пробирки добавляют 3—5 мл 10 % раствора гидрокарбоната натрия.
При выращивании микобактерий на предметных стеклах (метод микрокультур Прайса) вирулентные штаммы характеризуются ростом в виде жгутов или кос за счет образования корд-фактора (рис. 14.3.2; на вклейке). На нескольких предметных стеклах делают толстые мазки, высушивают, обрабатывают несколько минут 2—6 % серной кислотой и нейтрализуют. Затем стекла опускают во флаконы с гемолизированной цит-ратной кровью в разведении 1:4—1:8 и ставят в термостат. Через 7—14 дней извлекают стекла, фиксируют препарат, окрашивают по методу Циля—Нильсена и микроскопируют.
Идентификация микобактерий методом гибридизации ДНК ("ДНК-зондов"). Метод гибридизации ДНК применяют для быстрой идентификации чистой культуры микобактерий. Использование ДНК-зондов позволяет получить окончательный ответ в течение суток после завершения культивирования и, таким образом, существенно сокращает общий срок исследования. На сегодня существуют ДНК-зонды для идентификации только наиболее клинически значимых и широко распространенных микобактерий, вызывающих заболевания человека: комплекса M.tuberculosis, комплекса M.avium и M.kansassii. Таким образом, метод позволяет надежно идентифицировать представителей указанных видов и дифференцировать их от других патогенных микобактерий, а также от непатогенных сапрофитов, загрязняющих клинические образцы. Метод основан на гибридизации материала из чистой культуры с меченым ДНК-зондом, комплементарным видоспеци-фическим последовательностям в составе рРНК бактерий. Образовавшиеся в результате гибридизации ДНК-РНК-комплексы выявляют по наличию метки. Обычно используют флюоресцентную метку, присутствие которой легко обнаружить с помощью флюориметрии. Для надежной идентификации требуется не менее 105 бактерий. При этом чувствительность и специфичность метода составляют 100 %.
При высоком содержании возбудителя в клиническом образце использование коммерческих систем культивирования в сочетании с гибридизацией ДНК позволяет получить окончательный результат бактериологического исследования уже на 4—7-й день.
Идентификация микобактерий по липидному составу (хе моидентификация). Анализ количественного и качественного состава липидов клеточной стенки микобактерий (миколовых кислот) осуществляют с помощью газожидкостной или жидкостной хроматографии. Метод позволяет осуществить идентификацию любого из известных 50 видов микобактерий в течение 4 ч. Основными факторами, ограничивающими его широкое применение, являются необходимость использования дорогостоящего оборудования и техническая сложность интерпретации результатов.
Определение чувствительности возбудителя к антимикробным препаратам. Является обязательным этапом микробиологической диагностики туберкулеза и основой назначения адекватной этиотропной терапии. Традиционно определение чувствительности микобактерий осуществляют методом серийных разведений препарата в питательной среде. Наиболее надежным считается использование плотных питательных сред с последующим подсчетом числа выросших колоний. Исследование может занимать более 3 нед (до 3 мес), что обусловлено чрезвычайно низкой скоростью роста резистентных вариантов. Клинические границы устойчивости М.tuberculosis (МПК): стрептомицин — 5 мкг/мл, ПАСК — 10 мкг/мл, туба-зид — 1 мкг/мл, циклосерин и этионамид — 30 мкг/мл. Бактерии считают резистентными в том случае, если более 1 % клеток чистой культуры сохраняет способность к образованию колоний в присутствии указанной концентрации препарата.
Применение современных методов контроля роста бактерий (см. выше) позволило существенно сократить срок исследования (до 7—14 дней). Однако следует учитывать, что определение жизнеспособности бактерий в присутствии антибиотика по интенсивности их метаболической активности не всегда позволяет надежно дифференцировать чувствительную культуру от смешанной, содержащей 1—10 % резистентных бактерий. В настоящее время осуществляется интенсивная разработка более надежных методов контроля жизнеспособности, основанных на прямом подсчете числа живых бактерий с использованием проточной цитофлюориметрии, позволяющих избежать подобных ошибок.
Молекулярно-генетические методы определения чувствительности микобактерий к антимикробным препаратам. Методы ПЦР-диагностики позволяют обнаружить наличие у возбудителя генов, контролирующих резис-тентность к определенному препарату. Уже разработаны тест-системы на основе ПЦР для определения резистентности к препаратам группы рифампицинов.
Биопроба. Ранее для диагностики туберкулеза применяли биопробу: чистую культуру М. tuberculosis выделяли из органов животного, зараженного исследуемым материалом. Исследуемый материал обрабатывают серной кислотой для освобождения от посторонней микрофлоры, нейтрализуют и вводят подкожно в количестве 2—3 мл морской свинке и кролику с отрицательными туберкулиновыми реакциями. Через 4 мес, если животное не погибнет, его забивают, проводят макро- и микроскопическое исследование органов и делают посевы. Метод также применяется для определения вирулентности микобактерий. М.tuberculosis высокопатогенны для морских свинок и малопатогенны для кроликов. M.bovis высокопатогенны для кроликов. В настоящее время метод практически не применяется.
Экспресс-методы диагностики. Биохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. Метод позволяет обнаружить наличие видоспецифических нуклеиновых кислот микобактерий непосредственно в клиническом образце после обогащения. Исследование занимает около 4 ч. Существующие коммерческие тест-системы позволяют выявить в образце (мокроте, плевральном экссудате, пунктате лимфатических узлов и др.) присутствие МТС — бактерий комплекса М.tuberculosis (М.tuberculosis, M.bovis/BCG, M.africanum) и надежно дифференцировать их от нетуберкулезных микобактерий. Последнее имеет принципиальное значение для раннего эмпирического назначения этиотропной терапии, поскольку нетуберкулезные микобактерии, включая МЛ С, существенно отличаются от МТС по чувствительности к антимикробным препаратам.
Чувствительность метода приближается к 100 % только для образцов, в которых микобактерии были обнаружены бакте-риоскопическим методом, в других случаях она не превышает 90 %. Нельзя также исключить вероятность ложноположитель-ных результатов. Специфичность ПЦР по различным оценкам составляет 70—100 %. Таким образом, по чувствительности метод ПЦР сопоставим с бактериологическим исследованием, однако позволяет получить результат в течение 24 ч от момента получения материала.
Результаты ПЦР-диагностики рекомендуется интерпретировать в зависимости от данных бактериоскопического исследования. Получение положительного ответа бактериоскопичес-ким методом и ПЦР позволяет диагностировать туберкулез и рекомендовать немедленное назначение противотуберкулезных препаратов по классической схеме. Отрицательный результат ПЦР при наличии кислотоустойчивых микобактерии в мазках позволяет исключить присутствие МТС и рекомендовать назначение антимикробных препаратов, активных в отношении нетуберкулезных микобактерии. В других ситуациях рекомендуется ожидать результатов бактериологического исследования.
Серодиагностика. Антитела к антигенам возбудителя в крови пациентов можно обнаружить с помощью РСК, РИГА и других серологических реакций. Необходимо иметь в виду, что положительные результаты отмечаются не только при активном туберкулезном процессе в организме, но также при инфицировании М.tuberculosis и вакцинации, поэтому существенного диагностического значения не имеют.
Кожно-аллергическая проба. Ставится с туберкулином — очищенной белковой фракцией, полученной из фильтрата бульонной культуры М.tuberculosis. Используется для оценки течения туберкулезного процесса, определения эффективности вакцинации и отбора контингентов для ревакцинации против туберкулеза. Туберкулин вводят внутрикожно в строго определенной дозировке (реакция Манту). Результаты (появление гиперемии и образование папулы в положительном случае) учитывают через 24—48 ч (см. рис. 10.4.1).
• Микробиологическая диагностика проказы
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: соскоб слизистой оболочки носа, кожные лепрозные узлы, пунктат лимфатических узлов, мокрота и др.
243