Материал: Тец руководство

Применяют для обнаружения антигенов N.meningitidis в спин­номозговой жидкости в РИГА.

Коклюшная вакцина. Содержит взвесь В.pertussis, убитых формалином. Применяют для обязательной активной специ­фической профилактики коклюша. Входит в состав АКДС (ад­сорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина), которая включает также очищенные концентрированные диф­терийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на гидрате оксида алюминия.

Иммуноглобулин нормальный человеческий. Получен из пла­центарной или венозной крови человека. Содержит специфи­ческие антитела против возбудителей многих инфекционных заболеваний, в том числе возбудителя коклюша. Применяют для создания пассивного иммунитета с целью профилактики и лечения коклюша.

Агглютинирующие адсорбированные (факторные) сыворотки. Применяют для серологической дифференциации возбудите­лей коклюша.

Дифтерийный адсорбированный очищенный анатоксин (АД). Дифтерийный экзотоксин обезвреживают формалином при на­гревании, а затем очищают от балластных веществ, концент­рируют и адсорбируют на гидрате оксида алюминия. Приме­няют для профилактики дифтерии путем создания активного иммунитета. Входит в состав адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина (АДС) и АКДС.

Противодифтерийная антитоксическая сыворотка. Получена из крови лошадей, гипериммунизированных дифтерийным ана­токсином, очищена и концентрирована методом диаферм-3. Активность сыворотки изменяется в международных единицах. Применяют для экстренной профилактики и лечения дифте­рии за счет создания пассивного иммунитета.

Агглютинирующая противодифтерийная сыворотка (полива­лентная и типовые). Применяют для дифференциации C.diph-theriae от дифтероидов.

Антимикробные препараты: пенициллин и другие р-лактамы, хлорамфеникол, рифампицин, сульфаниламиды, тетрациклин, эритромицин.

Тема 14.3. ВОЗБУДИТЕЛИ ТУБЕРКУЛЕЗА, ПРОКАЗЫ И АКТИНОМИКОЗА

План

Программа

1. Биологические свойства возбудителей туберкулеза, микобактериозов, проказы и актиномикозов; их пато-генность, экология, особенности инфекции и эпиде­миология вызываемых заболеваний.

Микробиологическая диагностика.

Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

Демонстрация

1. Мазки для микроскопии:

Mycobacterium tuberculosis — мазки из чистой куль­туры и мокроты, окраска по методу Циля—Ниль­сена;

препарат М.tuberculosis в люминесцентном микроскопе;

Mycobacterium leprae — мазок со слизистой оболоч­ки носа, окраска по методу Циля—Нильсена;

Actinomyces spp. — друзы актиномицетов в ткани легкого.

Питательные среды для культивирования М.tuberculo­sis.

Рост микобактерий на среде Левенштейна—Йенсена.

Ниациновая проба для идентификации М.tuberculosis.

Определение чувствительности микобактерий к противотуберкулезным препаратам.

Рост актиномицетов на питательных средах.

Биохимические признаки для дифференциации акти­номицетов.

РСК для серодиагностики актиномикоза.

Задание студентам

1. Микробиологическое исследование при туберкулезе:

указать материал, подлежащий исследованию;

бактериоскопический метод: окрасить по методу Циля—Нильсена приготовленные из мокроты маз­ки и провести микроскопическое исследование. Сде­лать заключение и наметить ход дальнейшего ис­следования для подтверждения бактериоскопического диагноза;

бактериологический метод:

4 отметить характер роста исследуемой культуры

на среде Левенштейна—Йенсена, Ф отметить результаты ниациновой пробы, 4 определить чувствительность М.tuberculosis к ан­тимикробным препаратам: отметить наличие или отсутствие, роста микобактерий на среде Левен­штейна—Йенсена с разными концентрациями противотуберкулезных препаратов и сопоставить полученные данные с клиническими границами устойчивости микобактерий. Дать окончательное заключение по проведенным исследованиям.

2. Микроскопическое исследование при проказе:

1) указать материал, подлежащий исследованию;

2) бактериоскопический метод: микроскопировать и зарисовать окрашенный по методу Циля—Нильсе­на мазок со слизистой оболочки. Сделать заключе­ние. 3. Микробиологическое исследование при актиномикозе:

указать материал, подлежащий исследованию;

бактериоскопический метод: микроскопировать пре­парат из патологического материала. Сделать за­ключение;

бактериологический метод: на основании результа­тов исследования (морфологических, культуральных и биохимических свойств) идентифицировать культуру актиномицетов. Сделать окончательное за­ключение.

а Методические указания

• Микробиологическая диагностика туберкулеза

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: при легочном тубер­кулезе материалом для исследования являются мокрота, про­мывные воды бронхов, бронхоальвеолярная жидкость, плев­ральный экссудат, промывные воды желудка. Образцы мокро­ты необходимо собирать в течение 3—6 дней. Если пациент откашливает недостаточное количество мокроты, отделение можно облегчить (индуцировать) путем вдыхания аэрозоля по­догретого гипертонического (5—15 %) раствора поваренной со­ли. При внелегочном туберкулезе материал для исследования выбирают в зависимости от локализации поражений. Это мо­жет быть кровь, спинномозговая жидкость, моча, синовиаль­ная жидкость, тканевые биоптаты (лимфатических узлов, кост­ного мозга, печени, кожи и подкожной жировой клетчатки и др.), испражнения. Нестерильный материал, контаминирован-ный нормальной микрофлорой (мокрота, промывные воды бронхов, бронхоальвеолярная жидкость, промывные воды же­лудка, материал из пораженных участков кожи и подкожной жировой клетчатки, испражнения) для предотвращения раз­множения посторонних бактерий сразу после отбора должен быть помещен в холодильник и храниться до исследования при температуре 4—8 °С.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Первичная обработка клинического материала. Нестерильный материал нуждается в предварительной деконтаминации (унич­тожении посторонней микрофлоры). Для исследования вязко­го и негомогенного материала, содержащего тканевой детрит (мокрота, бронхоальвеолярная жидкость и др.), требуется также произвести процедуру разжижения и гомогенизации. По­скольку клинические образцы обычно содержат малое количе­ство микобактерий, желательно производить обогащение ис­следуемого материала. Обычно с целью гомогенизации/декон-таминации материал обрабатывают муколитическими (М-аце-тил-Ь-цистеин) и антибактериальными агентами (10 % Na₃PO₄, 1—2 % NaOH и др.). Далее бактерии концентрируют путем осаждения (центрифугирование 15—20 мин при 3000 g). При этом клеточный детрит и погибшие посторонние микроорга­низмы удаляются в виде супернатанта. Осадок ресуспендируют в минимальном объеме стерильной воды или изотонического раствора хлорида натрия и используют для дальнейшего иссле­дования. Применяют и другие методы деконтаминации, гомо­генизации и обогащения материала. Тканевые биоптаты перед исследованием необходимо гомогенизировать.

Бактериоскопическое исследование (схема 14.3.1). Бактерио-скопическая диагностика туберкулеза основана на выявлении в материале кислотоустойчивых бактерий с помощью специ­альных сложных методов окраски.

Выявление микобактерий классическим методом Циля— Нильсена является весьма трудоемкой процедурой. Кислото­устойчивые бактерии окрашиваются в ярко-красный цвет, рас­полагаются поодиночке или небольшими скоплениями (см. рис. 2.2.2). Препараты из мочи обязательно обесцвечивают не только кислотой, но и спиртом для дифференциации M.tuber-culosis от M.smegmatis, которые могут находиться в моче здоро­вых людей. В отличие от М.tuberculosis они обесцвечиваются спиртом. Мазок исследуют иммерсионным методом при уве­личении 900х—ЮООх, просматривая до 300 полей зрения. Ре­зультат считается положительным при обнаружении 1 или бо­лее кислотоустойчивых бактерий на 100 полей зрения. Отсут­ствие кислотоустойчивых бактерий при просмотре 300 полей зрения следует трактовать как отрицательный результат. Ок­раску по методу Циля—Нильсена применяют преимуществен­но для изучения выделенных чистых культур.

В качестве основного метода выявления микобактерий в материале от больного в настоящее время применяют люми­несцентную микроскопию мазков, окрашенных флюорохро-мом аурамином О по методу Боя (последующая обработка 3 % раствором НС1 в абсолютном этаноле обеспечивает обесцвечи­вание некислотоустойчивых бактерий). Этот метод облегчает исследование, поскольку позволяет использовать меньшее уве­личение (250х или 450х) и просматривать меньшее число полей зрения (30—70 в зависимости от увеличения).

Независимо от метода окраски бактериоскопическое иссле­дование позволяет обнаружить бактерии при их концентрации не менее 5000—10 000 в 1 мл образца, поэтому отрицательный результат не позволяет исключить заболевание.

Микроскопическое исследование является ориентировоч* ным и дает возможность судить лишь о наличии в материале кислотоустойчивых бактерий без определения их видовой при* надлежности. Метод не позволяет дифференцировать микобак-терии между собой и от других кислотоустойчивых микроор­ганизмов. Легочные и внелегочные поражения в первую оче­редь у лиц с иммунодефицитом различной этиологии могут быть вызваны не только бактериями комплекса Mycobacterium tuberculosis (МТС), но также и нетуберкулезными микобакте-риями: бактериями комплекса M.avium (MAC), M.kansassii, реже другими представителями рода Mycobacterium, Посколь­ку нетуберкулезные микобактерии являются обитателями ок­ружающей среды, загрязняющими воду, продукты, системы принудительной вентиляции/кондиционирования воздуха и др., они могут также присутствовать в образце как контами-нанты.

Бактериоскопическое исследование считается оптимальным методом ориентировочной экспресс-диагностики туберкулеза.

Бактериологическое исследование. Считается ведущим мето­дом диагностики туберкулеза, поскольку обладает достаточно высокой чувствительностью, специфичностью и обеспечивает материал (чистую культуру), необходимый для определения чувствительности возбудителя к противомикробным препара­там.

Для выделения чистой культуры микобактерии производят посев исследуемого материала на специальные жидкие или плотные питательные среды. Для выделения микобактерии из нестерильного материала желательно использовать селектив­ные среды, содержащие антимикробные препараты, подавляю­щие рост посторонних микробов. Для культивирования мико­бактерии применяют плотные яичные (среда Левенштейна— Йенсена) и агаровые среды, а также ряд синтетических жидких питательных сред.

Среда Левенштейна—Йенсена готовится из суспензии све­жих яиц, картофельной муки, глицерина, аспарагина, Ю^РОф суль­фата и цитрата магния и малахитового зеленого. Среду свертывают в наклонном положении при 85 "С в течение 45 мин.

Большинство питательных сред выпускаются микробиоло­гической промышленностью в виде полуфабрикатов или в го­товом виде. Поскольку на жидких средах скорость роста ми­кобактерии выше, чем на плотных, для ускорения исследова­ния рекомендуется осуществлять посев одновременно на плотную и жидкую среду. Посевы необходимо инкубировать в атмосфере с повышенным содержанием СС>2 (5—10 %). Мини­мальный срок инкубации составляет не менее 8 нед. Посевы первый раз просматривают на 3—5-й день после внесения материала, далее — 2 раза в неделю. Начиная с 5-й недели культивирования — 1 раз в неделю. Культуры М.tuberculosis имеют вид сероватого или светло-кремового морщинистого или крошкообразного сухого налета (рис. 14.3.1; на вклейке). Еще до появления видимых невооруженным глазом макроско­пических колоний на плотных средах с помощью микроскопии могут быть обнаружены микроколонии. Отсутствие микробно­го роста через 8 нед культивирования следует расценивать как отрицательный результат.