Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии

182

первого компонента на носителе. Состав буфера: 17,9 г Na2НРО4·12Н2О; 0,8 г NaН2РО4·2Н2О; 42,5 г NaCl; 2,5 мл твина-20. Объем буфера доводят до 5 л дистиллированной водой, хранят при 20-25°С.

Буфер для отмывания компонентов реакции – изотонический раствор хлорида натрия, содержащий 0,05% твина-20. В качестве отмывочного буфера можно также использовать фосфатно-солевой раствор с 0,05% твина-20.

Ортофенилендиамин готовят ex tempore следующим образом: 10 мг ортофенилендиамина, 6,1 мл 0,1 М лимонной кислоты, 6,4 мл 0,2 М Na2НРО4·12Н2О (для полного растворения подогреть на водяной бане), 12,5 мл дистиллированной воды, 0,35 мл 3% Н2О2. Растворяют 80 мг 5-аминосалициловой кислоты в 100 мл дистиллированной воды, доводят рН раствора до 6,0 ex tempore с помощью 1 М NaОН. Перед использованием на каждые 9 мл раствора добавляют 1 мл 0,05% перекиси водорода.

Методика проведения ИФА в лунках планшета. Первый этап ИФА -

сорбция соответствующего разведения антител или антигенов (в концентрации 1020 мкг/мл) в карбонатно-бикарбонатном буфере (в объеме 0,1 мл) на твердую фазу в течение 1-2 часов при температуре 37°С и 10-12 часов при 4°С (сенсибилизация). Затем отмывают лунки (для удаления несорбированных на носителе антител или антигенов) водопроводной водой, отмывочным буфером с 0,05% твина-20 в течение 5 минут (два раза) при комнатной температуре. После этого вносят в каждую лунку (твердую фазу) по 0,1 мл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина на карбонатно-бикарбонатном буфере и инкубируют в течение 1 часа при температуре 37°С для закрытия участков поверхности лунок, оставшихся свободными после сенсибилизации. Лунку отмывают от несвязанного бычьего сывороточного альбумина и вносят исследуемый материал (антигены или антитела) по 0,1 мл в разведениях на фосфатно-солевом растворе (рН 7,2) с 0,05% твина-20. Каждое разведение материала вводят в две лунки, и планшеты помещают в термостат на 1-3 часа при температуре 37°С. Непрореагировавшие в иммунной реакции антигены или антитела отмывают и в лунки вносят по 0,1 мл конъюгированных антител против исследуемого антигена или антитела в рабочем разведении на фосфатно-солевом растворе с 0,05% твина-20. Затем планшеты инкубируют в течение 2 часов при 37OС. Несвязавшийся конъюгат трижды отмывают буфером.

В лунку вносят 0,1 мл смеси растворов субстрата и хромогена и выдерживают 30 минут в темноте при комнатной температуре. В процессе инкубации пероксидаза разрушает субстрат (Н2О2) с образованием активного кислорода, который окисляет хромоген. В результате хромоген меняет цвет: ортофенилендиамин окрашивается в желтый цвет, а аминосалициловая кислота - в коричневый.

Для остановки реакции расщепления субстрата в лунку добавляют по 0,1 мл

1N H2SO4 (или 1М NaОН).

Контроль реакции - исследуемые антигены или антитела заменяют гомологичным компонентом реакции.

Контроль конъюгата - 0,1 мл 1% бычьего сывороточного альбумина на карбонатно-бикарбонатном буфере + 0,1 мл конъюгированных антител в рабочем разведении.

При визуальном учете выявляют то наибольшее разведение исследуемого материала, в котором окраска интенсивнее, чем в контроле (с бычьим

183

сывороточным альбумином). При учете результатов реакции с помощью фотоэлектроколориметра положительным считается то наибольшее разведение исследуемого материала, где уровень экстинкции не менее чем в 2 раза превышает уровень экстинкции соответствующего разведения гетерологичного компонента реакции.

Для получения антител, конъюгированных ферментом, необходимы высокоактивные преципитирующие сыворотки против антигенов или против глобулинов животных или человека, из которых выделяют гамма-глобулиновую фракцию. Иммуноглобулины конъюгируют с ферментом при помощи глютаральдегида. Несвязанный фермент удаляют диализом или хроматографией на сефадексе. Для предупреждения микробной деградации в конъюгаты вносят мертиолят до 0,01% и хранят при 4°С в замороженном или лиофильно высушенном состоянии.

Принципы иммуноферментного анализа используются для дифференциации инфицированности организма микобактериями и инфекционного туберкулезного процесса, начиная со стадии латентной туберкулезной инфекции. Указанная технология иммунодиагностики туберкулеза была разработана в начале 2000-х годов. Эта технология получила название “тест высвобождения гамма-

интерферона” – Interferon-gamma release assays (IGRA). Суть этого теста заключается в том, что в организме, в котором идет инфекционный процесс, вызванный Mycobacterium tuberculosis, Т-лимфоциты под воздействием микобактериальных антигенов, специфичных именно для этого возбудителя, начинают выделять гамма-интерферон (INF-γ). В организме, где туберкулезного процесса нет, такой реакции не будет. Следовательно, “тест высвобождения гаммаинтерферона” не позволяет установить факт инфицированности, а выявляет только наличие активной инфекции, начиная со стадии латентной туберкулезной инфекции, не затрагивая стадию инфицирования.

Для проведения IGRA-теста берут кровь пациента, выделяют лимфоциты, добавляют к ним микобактериальные антигены и определяют выделение Т- лимфоцитами гамма-интерферона. Для активации Т-лимфоцитов используют смесь 2 или 3 выборочных антигенов микобактерий, не встречающихся в вакцинном штамме БЦЖ и отсутствующих у нетуберкулезных микобактерий. Эти антигены присутствуют только у возбудителя туберкулеза человека (Mycobacterium tuberculosis) и у микобактерий “туберкулезного комплекса” (M. bovis, M. africanum,

M.microti, M. canetti).

ВРоссии доступны 2 вида IGRA-тестов: QuantiFERON и T-SPOT.TB. Эти тесты различаются методикой учета результатов. QuantiFERON-тест определяет количество (концентрацию) гамма-интерферона в исследуемом образце. T- SPOT.ТВ-тест проводит подсчет количества клеток, выделяющих гаммаинтерферон. Подсчет ведут по окрасившимся “отпечаткам” лимфоцитов на дне лунки, где проводилась инкубация.

QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus-тест) зарегистрирован в РФ в 2010

г. QFT-Plus-тест выявляет клеточный иммунный ответ на пептидные антигены, симулирующие микобактериальные протеины. Антигены, используемые в QFT- Plus-тесте, представляют собой пептидную смесь протеинов ESAT-6 и CFP-10. Эти

184

антигены стимулируют образование гамма-интерферона в Т-клетках лиц, инфицированных M. tuberculosis и микобактериями “туберкулезного комплекса”.

В состав QFT-Plus-теста входят 2 пробирки ТВ1 и ТВ2. Пробирка ТВ1 содержит пептиды ESAT-6 и CFP-10, стимулирующие CD4-лимфоциты. Пробирка ТВ2 содержит дополнительные пептиды, стимулирующие CD8-лимфоциты (ЦТЛ).

Забор крови производят в четыре специальные пробирки: две пробирки содержат микобактериальные антигены, одна пробирка является нулевым контролем и одна пробирка включает митоген – положительный контроль (рисунок

188).

Рисунок 188 – Тест-система QuantiFERON. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

После забора крови (по 1 мл в каждую пробирку) пробирки тщательно перемешивают и инкубируют при температуре 37ОС в течение 16-24 часов. Затем пробирки центрифугируют в течение 15 минут при 2000-3000 q, осторожно отбирают плазму крови и исследуют ее на наличие гамма-интерферона. Обнаружение гамма-интерферона (в МЕ/мл) в квантифероновом тесте проводится по методике твердофазного гетерогенного иммуноферментного анализа в 96луночном планшете. Для этого в лунки вносят образцы исследуемой плазмы и конъюгат, тщательно перемешивают на шейкере в течение 1 минуты и инкубируют при комнатной температуре в течение 120 минут. После этого каждую лунку промывают не менее 6 раз буферным раствором с использованием автоматической мойки для планшетов. Затем в каждую лунку вносят раствор ферментного субстрата, перемешивают на шейкере и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации в лунки добавляют стоп-реагент, перемешивают и измеряют оптическую плотность в каждой лунке планшета с помощью считывающего устройства для микропланшетов (рисунок 189).

185

Рисунок 189 – Квантиферроновый тест, ИФА. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Положительный результат – INF-γ-ответ в пробирке с микобактериальным антигеном значительно превышает ответ в нулевой контрольной пробирке. Сомнительный результат – слабый ответ на митоген (<0,5 МЕ/мл) при отрицательном ответе на антиген. Интерпретация результатов проводится с помощью рекомендуемого программного обеспечения.

T-SPOT.TB (Т-спот, иммунологический тест на туберкулез) зарегистрирован в РФ в 2012 г. Иммунологический тест на туберкулез представляет собой исследование иммунного Т-клеточно-опосредованного ответа, то есть количественное определение в крови эффекторных Т-клеток (CD4 и CD8), вырабатывающих гамма-интерферон, который продуцируется в ответ на стимуляцию микобактериальными антигенами ESAT-6 и CFP-10. Этот тест является упрощенным вариантом иммуноферментного метода, в котором продуцируемый гамма-интерферон связывается с соответствующими антителами рядом с секретирующей его клеткой еще до захвата рецепторами соседних клеток или разрушения. В состав набора входят следующие компоненты:

-микротитровальный планшет (в рамке 12 стрипов по 8 лунок в каждом), на котором сорбированы мышиные поликлональные антитела к гамма-интеферону человека (IFN-y);

-антиген ESAT-6;

-антиген CFP-10;

-положительный контрольный образец (положительный контроль) - фитогемагглютинин (ФГА) для контроля функциональных свойств клеток;

-коньюгат: мышиные моноклональные антитела к гамма-интерферону, конъюгированные со щелочной фосфатазой;