Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии
186
- субстрат: раствор 5-бромо-4-хлоро-3-индол-фосфата с нитротетразолиумом синим.
Диагностический набор для T-SPOT.TB – теста представлен на рисунке 190.
Рисунок 190 – Диагностический набор для тест-системы T-SPOT.TB. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Забор крови производят в пробирки для забора крови, рекомендуемые инструкцией. В лаборатории из крови получают мононуклеарные клетки методом, описанным в инструкции к тесту (промывание и центрифугирование в среде для выделения мононуклеаров). Затем подсчитывают в суспензии количество мононуклеарных клеток и готовят клеточную суспензию с концентрацией 2,5х105 клеток/100 мкл. Мононуклеарные клетки инкубируют с микобактериальными антигенами ESAT-6, CFP-10 для стимуляции имеющихся сенсибилизированных Т- клеток. Секретированный этими клетками гамма-интерферон связывается и удерживается специфическими антителами, находящимися на поверхности мембраны, выстилающей лунку, остальные клетки удаляются при промывании. Затем в лунки добавляются специфические антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой (конъюгат). Несвязавшийся конъюгат удаляется при промывании. После этого в каждую лунку добавляется субстрат, который расщепляется связанным ферментом. В месте реакции образуется пятно нерастворимого преципитата, соответствующее одной Т-клетке, секретирующей гамма-интерферон. Количество образующихся пятен является количественной характеристикой содержания сенсибилизированных микобактериями Т-клеток.
Принцип T-SPOT.TB-теста представлен на рисунке 191.
187
Внесение в лунки Т-клеток и антигенов. |
Интерферон захватывается |
Т-клетки высвобождают интерферон. |
антителами |
Добавление конъюгированных с |
Добавление субстрата, оценка |
|
ферментом антител к |
||
результатов по количеству пятен |
||
интерферону |
||
|
Рисунок 191 – Принцип T-SPOT.TB-теста. Заимствовано и адаптировано из Интернет-ресурсов.
Интерпретация результатов: отрицательный результат – менее или равный 4, пограничный – от 5 до 7, положительный – более или равный 8.
Сравнительные характеристики указанных тестов представлены в таблице 22.
Таблица 22 – Сравнительные характеристики тестов T-SPOT.TB и QuantiFERON
Характеристики |
T-SPOT.TB |
QuantiFERON |
Исследуемый образец |
Изолированные и |
2-3 мл цельной крови |
|
очищенные мононуклеары |
|
|
(4 мл крови). Требуется |
|
|
строго определенное |
|
|
количество клеток на |
|
|
лунку |
|
Детекция |
Число Т-клеток, |
Концентрация гамма- |
|
продуцирующих гамма- |
интерферона, |
|
интерферон |
секретируемого Т- |
|
|
клетками |
Обработка крови |
В течение 8 часов после |
В течение 16 часов после |
|
взятия крови |
взятия крови |
Антигены |
ESAT-6, CFP 10 |
ESAT-6, CFP 10, TB 7,7 |
Тип клеток |
CD4, CD8 |
CD4 |
Срок годности вскрытых |
8 недель при 2-8ОС |
12 недель при 2-8ОС |
реактивов |
|
|
188
9.6. Иммуноблоттинг
Иммуноблоттинг (ИБ, вестернблоттинг, англ. blot – пятно) представляет собой высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА. Для осуществления этого метода предварительно готовятся стрипы, представляющие собой полоски нитроцеллюлозной мембраны с нанесенными белками (антигенами). Для получения стрипов антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на нитроцеллюлозную мембрану, которую разрезают на полоски (стрипы). В лаборатории обработку стрипов проводят как в ИФА: на полоски наносят сыворотку больного, затем несвязавшиеся антитела отмывают и наносят антииммуноглобулиновую сыворотку, меченую ферментом (конъюгат). Образовавшийся комплекс (антиген + антитело больного + антитело против иммуноглобулина человека) выявляют с помощью хромогенного субстрата, изменяющего окраску под влиянием фермента. При наличии комплекса антиген- антитело-антисыворотка к иммуноглобулинам на стрипе появляются окрашенные зоны (рисунок 192).
Рисунок 192 – Схема иммуноблоттинга (Воробьев А.А., Быков А.С., 2003 г.).
9.7. Реакция иммунофлюоресценции
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, метод флюоресцирующих антител, МФА) основана на применении антител, меченных флуорохромными красителями (чаще всего флуоресцеина изотиоцианатом). Такие антитела, связываясь с соответствующим антигеном, вызывают свечение иммунных комплексов в УФлучах люминесцентного микроскопа. Имеющиеся в настоящее время автоматизированные технологии позволяют анализировать в одном образце около
189
50 различных антигенов с использованием набора различных флуоресцентных маркеров. Иммунофлуоресцентный анализ позволяет выявлять как антигены, так и антитела.
Существует 3 модификации иммунофлуоресцентного анализа:
-метод прямой иммунофлуоресценции применяют для выявления антигенов, сорбированных на твердой подложке, с помощью меченых антител. Реакция оценивается с помощью флуоресцентного микроскопа;
-метод непрямой иммунофлуоресценции позволяет выявлять немеченые антитела к известному антигену, сорбированному на твердой подложке. Комплексы антигена с антителом в этом случае выявляются с помощью меченых антител к иммуноглобулинам;
-метод конкурентной иммунофлуоресценции основан на связывании антител, сорбированных на твердой подложке, с меченым стандартным антигеном и немеченым антигеном, присутствующим в пробе. Так как меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, то по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в пробе.
Наиболее часто используют методы прямой и непрямой иммунофлуоресценции.
Прямая РИФ предусматривает использование коммерческих диагностических сывороток, содержащих антитела, меченые флюорохромами. На исследуемый препарат или в суспензию клеток вносят раствор меченых флюоресцентным красителем антител. Меченые антитела взаимодействуют с антигенами микроорганизмов с образованием комплексов, которые дают свечение в УФ-лучах люминесцентного микроскопа (рисунок 193).
Бактерия
Флюорохром
Рисунок 193 – Схема прямой РИФ. Заимствовано из Интернет-ресурсов. |
|
Прямая РИФ |
Непрямая |
Р
Прямая РИФ используется в диагностике многих бактериальных инфекций: коклюша, псевдотуберкулеза, чумы и др. (рисунок 194).
190
а б Рисунок 194 – Прямая РИФ в диагностике сифилиса (а) и риккетсиозов (б).
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Непрямая РИФ предусматривает использование 2 видов антител: кроличьи антитела к антигенам бактерий и антиглобулиновые антитела к иммуноглобулинам кролика. Антиглобулиновые антитела мечены флюорохромами. Непрямая РИФ ставится в два этапа. Вначале на препарат к бактериям добавляются кроличьи антитела, а затем – меченые антиглобулиновые антитела. Комплекс антигенантитело дает флюоресцентное окрашивание только после связывания двух антител между собой. Положительная реакция также оценивается по интенсивности свечения (рисунок 195).
Бактерия
•Ме
вст
|
|
вза |
|
|
Флюорохром |
стр |
|
|
|
оп |
|
Рисунок 195 – Схема непрямой РИФ. Заимствовано из Интернет-ресурсов. |
|||
ИФ |
Непрямая РИФ |
ко |
|
Использование |
биоинженерных иммуноглобулинов |
||
и высокая степень |
|||
очистки антител позволили практически свести на нет неспецифические реакции, что сделало возможным дальнейшее технологическое развитие метода иммунофлюоресценции.