Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии

226

-экстракция белков может быть проведена непосредственно на слайде;

-уверенность: одноразовые слайды исключают риск контаминации и не требуют мытья;

-высокое разрешение: высокая воспроизводимость идентификации спектров белков микроорганизмов в диапазоне более 10 кДа. Возможность сканирования веществ массой до 500 кДа;

-база данных состоит из клинически значимых видов и более 25000 спектров. Надежная валидация с использованием Расширенного Классификатора Спектров для достоверной идентификации. Для каждого вида в базе данных получены спектры большого количества штаммов.

Метод позволяет проводить и субтипирование микроорганизмов. Этапы масс-спектрометрического анализа:

-пробоподготовка (первичный посев клинического материала на питательную среду);

-мягкая ионизация - MALDI;

-сортировка ионов по массам и по времени пролета (TOF);

-идентификация (Biotyper).

Возможности и преимущества метода MALDI:

-замена всех морфологических и биохимических методов идентификации;

-точность исследования приближается к 100%;

-одинаковая простота идентификации анаэробов и аэробов;

-возможность идентификации микобактерий и плесневых грибов в день обнаружения роста.

Использование масс-спектрометрии в медицине:

-MALDI Biotyper - экспресс идентификация микроорганизмов;

-GENOLINK - генотипирование олигонуклеотидных полиморфизмов и оценка качества олигонуклеотидов;

-CLINPROT - поиск пептидных маркеров заболевания (белковое профилирование);

-ImagePrep - поиск молекулярных маркеров на гистологических срезах (молекулярная гистология);

-ProteinScape – исследования в области протеомики.

Метод матрично-активированной лазерной десорбции / ионизации был разработан для анализа высокомолекулярных соединений в 1985 г. немецкими учеными Францем Хилленкампом и Михаелем Карасом. В этом методе в качестве матрицы использовалось низкомолекулярное органическое соединение. Но для ионизации белков они этот метод не применяли. Дело в том, что при массспектрометрическом методе анализируемая молекула ионизируется и переводится в газовую фазу под действием лазера. Это воздействие приводит к разрушению таких макромолекул как белки.

В 1985 г. Танака Коити запатентовал методику под названием SLD (soft laser desorption) - мягкая лазерная десорбция для масс-спектрометрического анализа. Он предложил использовать тонкий металлический порошок в глицерине в качестве матрицы. В этом случае макромолекулярные аналиты ионизируются без разрушения структуры самого вещества. В 1987 г. он доложил эту методику на ежегодной конференции Японского масс-спектрометрического общества. С этого времени

•

227

•

Коити

Рисунок 226 – Разработчики метода матрично-активированной лазерной десорбции /

(1959) (1936-2014) (1952)

ионизации: а – Танака Коити (род. в 1959 г.); б – Франц Хилленкамп (1936-2014 гг.); в – Михаель Карас (род. в 1952 г.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Сущность метода MALDI-TOF MS состоит в том, что с помощью лазерных импульсов органическое вещество микроорганизмов превращается в заряженные частицы – ионы (ионизация). При этом молекулы вспомогательного вещества (матрицы) и изучаемого белка под воздействием лазера переходят в газовую фазу. Под влиянием электрического поля ионы движутся от источника ионизации к детектору с ускорением, обратно пропорциональным атомным массам. Затем проводится сортировка ионов по массам (по отношению массы к заряду) и построение масс-спектр-графика. Сопоставление полученного спектра с имеющейся базой данных позволяет идентифицировать микроорганизмы. Идентификация микроорганизмов учитывает уникальный для каждого вида микроорганизмов набор белков – своеобразный “отпечаток пальца” (фингерпринтинг), “протеомная дактилоскопия”. Определение спектра белков проводится для бактериальных клеток из изолированной колонии с чашки первичного посева исследуемого материала. Идентификация осуществляется в основном по рибосомальным белкам, которые присутствуют во всех микроорганизмах. Принцип метода представлен на рисунке

227.

Время-пролетная масс-спектрометрия основана на измерении скорости пролёта каждой частицы микроорганизма и выведении на экран результатов “старта” и “финиша”. Вся процедура длится считанные секунды. Для молекул, полученных от разных микроорганизмов, характеристики уже известны, и прибору остаётся сравнить результаты с базой данных. Этот метод позволяет определять больше 4 тысяч видов микроорганизмов.

228

Рисунок 227 – Принцип MALDI-TOF MS. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Методика идентификации микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии включает следующие этапы (рисунок 228):

1 этап: подготовка образца (смешивание материала из отдельной колонии с раствором специальной матрицы на подложке масс-спектрометра). Время – 10-33 минуты. В качестве матрицы используют 2',5'-дигидроксибензойная кислота.

2 этап: идентификация (смесь помещают в прибор и подвергают воздействию неносекундных лазерных импульсов) – сравнивание масс-спектра исследуемого

материала со спектрами из базы данных. Время – 12-43 минуты. За 1 загрузку можно идентифицироваПоследовательность192 образца. операций

Шаг 1

Шаг 2

Шаг 3

Идентификация

по базе данных

Получение

масс-спектра

Рисунок 228 – Последовательность операций при масс-спектрометрии. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

229

Технология идентификации микроорганизмов методом MALDI-TOF реализована в нескольких анализатора, в том числе в лабораторном комплексе Vitek MS (БИОМЕРЬЕ, Франция). В этом анализаторе на идентификацию одного микроорганизма требуется 2 минуты. Затраты по времени для подготовки 24 изолятов составляют 10 минут, для 96 изолятов – 33 минуты.

Совмещение анализаторов Vitek MS и Vitek 2 позволило компании БИОМЕРЬЕ обеспечить решение двух задач – идентификации бактерий и определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Анализатор Vitek MS (рисунок 229) позволяет проводить идентификацию и определение чувствительности культур к антибиотикам. Микроорганизмы наносятся на слайд, добавляется матрикс и запускается анализ. За 1 загрузку анализируется до 192 образцов.

Рисунок 229 - Анализатор Vitek MS. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Приборное оснащение микробиологических масс-спектрометрических исследований постоянно совершенствуется. Например, времяпролетный МАЛДИ масс-спектрометр Bruker Microflex LT представляет собой настольный вариант для клинических лабораторий (рисунок 230).