Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии

216

Полученные результаты можно документировать, фотографируя электофореграммы с использованием оранжевого светофильтра (рисунок 221).

Рисунок 221 – Источник тока и камера для электрофореза. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Существуют автоматизированные системы визуализации гелей, включающие трансиллюминатор, видеокамеру и компьютер.

В настоящее время разработаны методы ПЦР для выявления многих бактерий (микобактерии, хламидии, микоплазмы, сальмонеллы, легионеллы и др.) и вирусов (ВИЧ, вирусы герпеса, цитомегаловирус, вирусы папилломы, вирус краснухи и др.).

Преимущества ПЦР перед другими методами диагностики инфекционных заболеваний:

-прямое определение наличия возбудителей (выявление участка ДНК конкретного возбудителя);

-высокая специфичность (выявление уникального фрагмента ДНК, характерного только для данного возбудителя);

-высокая чувствительность (присутствие в пробе 10-100 микробных клеток);

-универсальность процедуры выявления различных возбудителей;

-высокая скорость получения результатов анализа (4-5 часов);

-возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций (диагностика трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов).

Ограничения метода ПЦР:

-амплификация ДНК как живых, так и погибших микроорганизмов;

-возможность перекрестной реакции и ложноположительных результатов;

-изменчивость микроорганизмов.

Различают несколько разновидностей ПЦР.

1. ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ, Real-time PCR, RT-PCR) позволяет отслеживать накопление ампликонов непрерывно в ходе реакции по флюоресценции зондов и не требует проведения электрофореза. Для проведения ПЦР-РВ в реакционную смесь добавляется специфический флуоресцентный зонд (например,

218

meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae. В мультиплексной ПЦР используются меченые флуорофорами пробы. Для каждого возбудителя проба помечена определенным красителем, что позволяет дифференцировать ампликоны.

4.ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, Reverse Transcription PCR, RT-PCR) используется для выявления РНК-содержащих вирусов путем синтеза на матрице вирусной РНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы) комплементарной ДНК, которую в последующем применяют в качестве матрицы в стандартной ПЦР.

В качестве праймеров используют случайные (рэндом) праймеры, состоящие из 6 нуклеотидов. Такие праймеры могут использоваться обратной транскриптазой. Обратная транскрипция проводится при стабильной температуре 37ОС. Праймеры связываются с молекулами РНК, после чего обратная транскриптаза достраивает комплементарную цепочку ДНК. Причем, обратной транскрипции подвергаются все виды РНК, присутствующие в реакционной смеси.

В качестве праймеров используются также олиготимидиновый праймер. Такой праймер не связывается с клеточными рибосомными и транспортными РНК, что позволяет избавиться от значительной части балластной РНК.

5.Гнездовая (“вложенная”) ПЦР (Nested PCR) осуществляется последовательно с двумя парами праймеров (ДНК продукты, образуемые в реакции

спервой парой праймеров, используют для последующего взаимодействия со второй парой праймеров). Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

6.ПЦР с использованием произвольных праймеров, ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК (ПП-ПЦР, Random Amplification of Polymorphic DNA PCR, RAPD-PCR) основана на использовании коротких праймеров, способных связываться с разными участками ДНК. В результате этого происходят амплификации нуклеотидных последовательностей в различных областях генома с образованием многочисленных фрагментов разной длины, по количеству и размерам которых судят о групповой или видовой принадлежности микроорганизма. Указанная ПЦР используется при необходимости отличить близкие по генетической последовательности организмы.

7.Широкодиапазонная ПЦР предусматривает использование универсальных праймеров, взаимодействующих с высоко консервативными участками ДНК, встречающимися у многих микроорганизмов (например, гены, кодирующие рибосомы 16S и 23S). В частности, широкодиапазонную ПЦР применяют для выявления в клиническом материале неизвестных и некультивируемых микроорганизмов.

8.“Инвертированная” ПЦР (Inverse PCR) используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.

9.“Ассиметричная” ПЦР (Asymmetric PCR) проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в

219

некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.

10.Ступенчатая ПЦР (Touchdown или Stepdown PCR) позволяет уменьшать влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определенной температуре система пройдет через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК.

11.ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) является модификацией ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч оснований и больше). Используют 2 полимеразы, одна из которых – Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая – ДНК полимераза с 3'-5' эндонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой.

11.5.Лигазная цепная реакция

Воснове метода лежит способность специфического фермента ДНКзависимой ДНК-лигазы сшивать цепь ДНК в присутствии АТФ и ионов магния при наличии разрыва фосфоэфирной связи. Используется термостабильная лигаза и 4 специфических олигонуклеотида, добавляемых в реакционную смесь в избытке. Каждые 2 олигонуклеотида комплементарны к детектируемому специфическому фрагменту цепи ДНК-матрицы и непосредственно примыкают друг к другу, одновременно они комплементарны и второй паре олигонуклеотидов. После денатурации ДНК-матрицы при 95ОС олигонуклеотиды связываются специфическими фрагментами цепей ДНК-матрицы и лигируются при 50ОС. Далее эти две стадии цикла повторяются много раз, в результате чего происходит экспоненциальное возрастание соединенных ковалентной связью олигонуклеотидов. Для быстрого количественного обнаружения лигированных олигонуклеотидов применяют 2 метки: биотин на одном конце и флуоресцеин – на другом конце лигированных олигонуклеотидов. В последующем фрагменты связываются антифлуоресцеиновыми антителами на поверхности мембраны или микропланшета. Антибиотиновые антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой, также количественно взаимодействуют с образовавшимся фиксированным комплексом и после добавления субстрата дают окрашенный продукт.

11.6. Секвенирование

Секвенирование представляет собой метод, позволяющий определять последовательность нуклеотидов (аденина, тимина, гуанина и цитозина) в молекуле ДНК. Цели секвенирования:

220

-расшифровка генома – определение количества генов, их протяжённости, локализации, функций;

-идентификация неизвестных микроорганизмов путем сравнения нуклеотидной структуры некоторых их генов с соответствующими последовательностями известных видов;

-определение мутаций в генах для выявления резистентных микроорганизмов и изучения молекулярных механизмов устойчивости;

-эпидемиологические исследования (определение генетических различий штаммов одного вида, выделяемых в разное время и из разных источников для определения связей между циркулирующими в различных регионах и стационарах микроорганизмов);

-оценка сходства микроорганизмов и их происхождения.

Методика секвенирования. Готовят реакционную смесь, состоящую из изучаемой ДНК, праймера, ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), меченых флюоресцентной меткой дидезоксинуклеотидов. Затем проводят ПЦР, позволяющую получить множественные копии небольших фрагментов ДНК размером от 300 до 1000 нуклеотидов. Секвенирование больших фрагментов затруднено, так как при проведении их электрофореза невозможно выявить фрагменты, отличающиеся в один нуклеотид. После этого очищают амплифицированные фрагменты ДНК от остатков ПЦР (праймеров, несвязавшихся нуклеотидов) и проводят электрофорез в полиакриламидном геле для разделения фрагментов ДНК, отличающихся в один нуклеотид. Результатом секвенирования является первичная структура секвенированного фрагмента ДНК, которую идентифицируют с помощью компьютерных программ.

Другие варианты секвенирования.

Крупномасштабное секвенирование, позволяющее секвенировать большие фрагменты ДНК, например, целую хромосому микроорганизмов. ДНК нарезают на фрагменты при помощи рестриктаз. Эти небольшие фрагменты при помощи вектора переносят в Escherichia coli (клонируют). Микроорганизмы, размножаясь, приводят к накоплению клонированной ДНК (клональная амплификация). Далее все разновидности клонированных фрагментов ДНК секвенируют и при помощи компьютера собирают в единую длинную цепочку. Такой подход не требует предварительной информации об изучаемой ДНК, поэтому относится к секвенированию de novo.

Секвенирование с использованием гибридизации. В его основу положены гибридизационные биочиповые технологии. При этом неизвестная ДНК обрабатывается флюоресцентным красителем и наносится на чип с большим количеством зондов разной специфичности, находящихся в разных участках чипа. Тот участок чипа, где отмечается сильная флюоресценция, свидетельствует о комплементарности зонда и изучаемой ДНК, что позволяет идентифицировать ДНК, зная характер зонда.

Микрожидкостное секвенирование по Сенджеру. Проводится с использованием всех стадий секвенирования по Сенджеру: ПЦР, очистки продуктов амплификации, электрофореза. Реакция осуществляют в специальных чипах, при этом объем реакции измеряется в нанолитрах, что способствует меньшему расходу