Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии

211

метод молекулярной гибридизации используется при идентификации трудно культивируемых или медленно растущих микробов (представителей родов

Mycobacterium, Neisseria, Campylobacter).

Метод молекулярной гибридизации требует большого количества молекулярных зондов, времени, сложен в постановке, не отличается высокой чувствительностью и широкого практического применения не нашел.

Молекулярная гибридизация проводится в растворах, в тканевых срезах, на микрочипах (эррей гибридизация) и на мембранах. Наиболее распространенной является гибридизация на мембранах. Для этого исследуемую ДНК с помощью рестриктаз разрезают на мелкие фрагменты, которые фиксируют на мембране. Фрагменты наносят в виде точек (дот-блоты) или в виде полосок (слот-блоты). Затем к фрагментам ДНК добавляют специфические меченые зонды. Гибридизацию проводят при температуре 65ОС. В случае комплементарности зонд связывается с ДНК. Некомплементарные несвязавшиеся зонды удаляются промыванием. В месте связывания зонда регистрируют флюоресценцию или изменение цвета.

11.4. Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, Polymerase chain reaction, PCR)

позволяет обнаруживать геном возбудителя в исследуемом материале без выделения чистой культуры. Метод амплификации ДНК (многократного увеличения числа копий специфического фрагмента нуклеиновых кислот) в пробирке разработал в 1983 г. американский биохимик К. Муллис. За разработку метода ПЦР он в 1993 г. получил Нобелевскую премию по химии.

Суть ПЦР состоит в циклическом удвоении (амплификации) определенного участка ДНК с помощью специфических праймеров (затравок) и особых ферментов (полимераз). На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. В результате амплификации образуется множество копий (ампликонов) ДНК размером до 5000 п. о. В качестве амплифицируемых участков ДНК микроорганизмов могут выступать уникальные гены, характерные только для данного вида бактерий.

Принцип ПЦР. После температурной денатурации двухцепочечной ДНК образуются одноцепочечные молекулы, к которым присоединяются небольшие синтетические олигонуклеотиды – праймеры, комплементарные концам известного уникального фрагмента генома возбудителя. Праймеры присоединяются только к комплементарному участку на обеих цепях ДНК и ограничивают амплифицируемый фрагмент с двух сторон. К 3'-концу праймера прикрепляется ДНК-полимераза и на ДНК-матрице синтезируется копия ДНК. Синтез ДНК протекает только на участке между праймерами.

Каждая стадия происходит при определенной температуре. Каждый вновь синтезируемый фрагмент ДНК служит матрицей для синтеза двух новых нитей в следующем цикле амплификации. Переход от одной стадии к другой достигается изменением температуры инкубационной смеси. При многократном (30-40 раз) повторении этих циклов и оптимальном сочетании компонентов

212

реакционной смеси происходит экспоненциальное увеличение количества ампликонов. При наличии в исследуемом образце даже одной молекулы нуклеиновой кислоты образуется достаточное количество ДНК, которое можно выявить физико-химическими методами.

Исследуемый материал для ПЦР: соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма и сыворотка крови, плевральная и спинномозговая жидкости, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты тканей. Забор материала проводится с помощью стерильного, желательно одноразового, инструментария в одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, обработанные предварительно хромовой смесью, промытые дистиллированной водой и прокаленные в сушильном шкафу при температуре 150ОС в течение 1 часа.

Отобранные образцы могут храниться при комнатной температуре не более 2 часов. При необходимости пробы можно хранить в холодильнике при температуре 2-8ОС не более суток. Более продолжительное хранение (до 2 недель) возможно в морозильной камере при температуре минус 20ОС. Не допускается повторное замораживание – оттаивание проб.

Полимеразная цепная реакция включает в себя несколько этапов.

1.Подготовка пробы биологического материала (выделение ДНК из образцов). Суть этого этапа заключается в экстракции ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения чистого препарата ДНК, пригодной для амплификации. Метод выделения ДНК зависит от вида исследуемого материала. Чаще всего ДНК выделяют методом твердофазной сорбции. Для этого биоматериал обрабатывают лизирующим раствором, содержащим гуанидин изотиоцианат, для денатурации белков и высвобождения ДНК. Затем ДНК адсорбируют на сорбентах, многократно отмывают сорбенты от остатков лизирующего раствора и смывают нуклеиновую кислоту с сорбента буферным раствором.

При обработке сыворотки, плазмы или цельной крови используют метод фенольной экстракции. Этот метод включает депротеинизацию фенолом/хлороформом с последующим осаждением ДНК этанолом или изопропанолом.

2.Приготовление реакционной смеси. Компоненты реакционной смеси вносят микропипеткой в микропробирку, причём каждый раз наконечник микропипетки меняют во избежание контаминации.

Компонентами ПЦР являются:

- материал, содержащий искомую ДНК возбудителя - ДНК-матрица; - смесь четырёх дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфатов);

- ДНК-полимераза (Taq-полимераза), катализирующая полимеризацию ДНК; - два синтетических праймера (искусственно созданные затравки одноцепочечной ДНК длиной 18-30 оснований), комплементарные концам

требуемого конкретного фрагмента ДНК возбудителя; - специфический буфер, содержащий ионы магния, некоторые соли и

имеющий определенное значение рН.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) является “строительным материалом”, который использует Taq-полимераза для синтеза второй цепи ДНК. В

213

смесь входят дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ).

Taq-полимераза является термостабильным ферментом, обеспечивающим достраивание 3'-конца второй цепи ДНК по принципу комплементарности. Этот фермент выделен из Thermophilus aquaticus. Кроме Taq-полимеразы в ПЦР применяют Pfu-полимеразу (выделена из Pyrococcus furiosus), Pwo-полимеразу (выделена из Pyrococcus woesei) и другие ферменты.

Праймеры представляют собой пару искусственно синтезированных олигонуклеотидов, имеющих размер от 15 до 30 п. н., идентичных соответствующим участкам ДНК-матрицы. Праймеры получают, исходя из известных генов возбудителей в специальных аппаратах – синтезаторах. Для получения праймеров необходимо знание нуклеотидной последовательности микроорганизмов. Для проведения ПЦР необходимо два праймера, каждый из которых комплементарен одной из цепей ДНК. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

Буфер содержит смесь катионов и анионов в определенных концентрациях, обеспечивающих оптимальные условия для реакции.

Во избежание испарения реакционной смеси в пробирки добавляют высококипящее вазелиновое масло или используют амплификатор с подогревающейся крышкой.

Основные исходные компоненты ПЦР представлены на рисунке 217.

Рисунок 217 – Исходные компоненты ПЦР. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

3. Проведение амплификации ДНК (собственно ПЦР). При проведении ПЦР выполняются 25-30 циклов амплификации (термоциклирования), каждый из которых состоит из трех стадий.

3.1.Денатурация (плавление ДНК) протекает при температуре 93-95ОС в течение 30-40 секунд. В результате этого разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК, молекула ДНК “расплетается” и образуются одноцепочечные фрагменты. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2-5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой прием называется горячим стартом.

3.2.Отжиг (присоединение праймеров) происходит при температуре 5065ОС. Время отжига составляет 20-60 секунд. На этой стадии праймеры присоединяются к комплементарным участкам ДНК-мишени с образованием дуплексов. Праймеры подбираются таким образом, что они ограничивают

214

(фланкируют) искомый фрагмент ДНК и комплементарны противоположным цепям ДНК. Участок ДНК-матрицы, с которым связывается праймер, должен быть уникальным только для данного возбудителя.

3.3. Элонгация (достраивание цепей ДНК). На этой стадии ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь от 3׳-конца праймера, который связался с матрицей. Температура элонгации обычно составляет 70-72ОС. Время элонгации составляет 20-40 секунд.

В дальнейшем новые цепи ДНК служат матрицами для последующих циклов амплификации, и количество ампликонов с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии (рисунок 218).

Рисунок 218 – Экспоненциальное накопление копий ДНК в ходе ПЦР. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Поэтому за 30 циклов количество ампликонов, полученных из одной молекулы ДНК, достигает примерно 230 копий участка ДНК.

4. Детекция (визуализация ампликонов) производится несколькими способами:

-электрофоретическая детекция в агарозном или полиакриламидном геле;

-гибридизационно-ферментная детекция;

-гибридизационно-флуоресцентная детекция (регистрация продукта после окончания реакции амплификации – “анализ по конечной точке” и детекция продукта в режиме “реального времени”).

Наиболее распространенным до недавнего времени был метод горизонтального электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру в агарозном или полиакриламидном геле с бромистым этидием. Для выявления ДНК проводили электрофорез в агарозном геле, содержащем флюоресцирующий в УФ-свете бромид этидия. После электрофореза гель извлекали из электрофоретической камеры и переносили на столик трансиллюминатора (источника УФ-света), где бромистый этидий, связавшийся с ДНК, флюоресцирует в УФ-свете (оранжевое свечение).

В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса.

215

В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю, такая полоса должна отсутствовать. Наличие такой полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации (загрязнении) пробы.

Гибридизационная детекция проводится с использованием олигонуклеотидных зондов, содержащих метку (флуорофоры или интеркалирующие красители).

ПЦР проводится в амплификаторе (термоциклере) – приборе, который обеспечивает автоматическое периодическое охлаждение и нагревание пробирок с реакционной смесью (рисунок 219). Температурные режимы циклов в термоциклере изменяются автоматически в соответствии с заданной программой.

Рисунок 219 – Амплификатор для проведения ПЦР. Заимствовано из Интернетресурсов.

Схема ПЦР представлена на рисунке 220.

95 С Денатурация

Образец ДНК Праймеры Нуклеотиды

Taq-полимераза Буфер Пробирка

72 С Элонгация

Термоциклер

Рисунок 220 – Схема ПЦР. Заимствовано из Интернет-ресурсов.