Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии

201

связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске.

Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных соединений – вирусов, различных гормонов (например, в тестах на беременность), возбудителей бактериальных инфекций.

Метод конкурентого ИХА, используемый для определения низкомолекулярных соединений, основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъюгата аналит-белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате “антителометка”. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом “антитело-метка” на мембране. Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где иммобилизован конъюгат “аналит-белок-носитель”. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже занят аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии. В результате, отсутствие окрашенной полосы в тестовой зоне и наличие окраски в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста.

При отсутствии анализируемого вещества в образце конъюгат “антителометка” связывается с конъюгатом “антиген-белок-носитель”, иммобилизованным в зоне тестовой линии. Несвязавшийся конъюгат “антитело-метка” попадает в зону контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Таким образом, наличие двух окрашенных линий (тестовой и контрольной) является отрицательным результатом анализа.

Формат конкурентного ИХА используется для выявления низкомолекулярных соединений, в том числе метаболитов наркотических соединений в моче, жидкости ротовой полости, экстрактах тканей.

Преимуществом метода является быстрота и легкость его применения. В этом методе не требуется использование сложного оборудования, и анализ может быть проведен неспециалистом в любых условиях, в том числе в “полевых”.

Существуют также приборные полуколичественные и количественные форматы ИХА, в которых используются специальные ридеры для регистрации интенсивности метки в тестовой зоне тест-полоски.

В качестве меток в ИХА используются следующие вещества:

1.Красящие вещества (нано-частицы коллоидного золота или углерода, или частицы окрашенного латекса). В этом случае используется визуальная детекция результата, либо приборное колориметрическое определение (или сканирование). Использование различных красящих меток, присоединенных к частицам латекса, позволяет проводить мультианализ, в котором линии разного цвета соответствуют различным аналитам. Наиболее часто используемой меткой является нано-частицы коллоидного золота.

2.Флуоресцентные, фосфоресцентные и биолюминесцентные метки,

ковалентно связанные с частицами латекса. Эти метки используются только в

202

приборных вариантах ИХА, когда результат регистрируется специальным ридером. Среди вышеуказанных наиболее распространены флуоресцентные метки.

3.Парамагнитные метки (также закрепленные на частицах латекса). Данный вид меток используется в ИХА с применением приборов, регистрирующих силу магнитного поля.

4.Ферментные метки используются по тому же принципу, что и в ИФА. Ферментативная реакция регистрируется с помощью окрашивания субстратов, и результат анализа является визуальным, или считывается с помощью ридера.

Иммунохроматографические тесты выпускаются для конкретных целей. Например, обнаружение гемолизина BL и негемолитического энтеротоксина NHE B. cereus в пищевых продуктах осуществляют с помощью иммунохроматографического экспресс-теста Duopath® Cereus Enterotoxin (рисунок 207).

Рисунок 207 - Иммунохроматографический экспресс-тест Duopath® Cereus Enterotoxin для обнаружения энтеротоксинов B. cereus в пищевых продуктах. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для предварительного выявления сальмонелл в пищевых продуктах применяют экспресс-тест Singlepath® Salmonella – иммунохроматографический тест на основе меченных золотом антител. При наличии в пробе антигена (сальмонелл) образуется четкая красная линия (рисунок 208).

а б Рисунок 208 – Положительный (а) и отрицательный (б) результаты экспресс-теста

Singlepath® Salmonella. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

203

В настоящее время в диагностику сифилиса активно внедряется

иммунохроматографический анализ, позволяющий определять антитела к антигенам T. pallidum, иммобилизированным на мембране (тест-полоске). Этот тест позволяет провести диагностику сифилиса в домашних условиях (рисунок 209).

Рисунок 209 – Набор “Иммуно Хром-анти ТР-Экспресс” для экспресс-диагностики сифилиса. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для выявления кампилобактерий в пищевых продуктах фирма Merck (Германия) выпускает экспресс-тест Singlepath-Campylobacter, представляющий собой иммунохроматографический тест на основе меченных золотом антител (рисунок 210).

Рисунок 210 - Экспресс-тест Singlepath-Campylobacter для обнаружения кампилобактерий в пищевых продуктах. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

В иммунохроматографических тестах исследуемый материал вносится в круглую лунку, где антиген адсорбируется подложкой и часть его взаимодействует с меченными антителами. Комплекс “антиген+антитело” мигрирует в тестовую зону (Т), где связывается с антителами к этому комплексу. В результате взаимодействия образуется четкая красная полоса. Оставшаяся часть образца мигрирует далее в контрольную зону (С), где образует четкую красную полосу, указывающую на специфичность теста.

204

9.12.Феномен набухания капсулы

Вначале ХХ века немецкий бактериолог Ф. Нейфельд впервые с помощью типоспецифических антисывороток разделил пневмококки на серотипы. В настоящее время в соответствии с особенностями капсульных полисахаридов описано более 90 серотипов пневмококка. Для серотипирования пневмококков Ф. Нейфельд использовал метод набухания капсулы: при добавлении к взвеси бактерий противокапсульной сыворотки, содержащей антитела против капсульных полисахаридов данного серотипа пневмококков, происходит резкое увеличение (набухание) капсулы, которое хорошо видно при фазово-контрастном микроскопическом исследовании (рисунок 211).

а б Рисунок 211 – Реакция набухания капсулы по Нейфельду: а - отрицательная

реакция, б – положительная реакция (Алябьева Н.М., 2014 г.).

Реакция набухания капсулы (реакция Нейфельда, quellung reaction) остается основным методом серотипирования пневмококков и считается “золотым стандартом” дифференцировки пневмококков.

9.13. Реакция бактериолизиса

Реакция бактериолизиса проявляется растворением бактерий в результате взаимодействия с антителами в присутствии комплемента. Антитела, вызывающие лизис бактерий, называются бактериолизинами. В пробирочных тестах применяют иммунные сыворотки, инактивированные прогреванием на водяной бане при температуре 37ОС в течение 30 минут, что приводит к разрушению комплемента.

Для проведения реакции в опытную пробирку вносят 0,5 мл разведенной 1:10 инактивированной иммунной сыворотки, добавляют 0,1 мл взвеси живых микробов (концентрация – 1 млрд. микробных клеток в 1 мл) и 0,1 мл комплемента. Во вторую пробирку вносят только иммунную сыворотку и микробную взвесь. В третью пробирку вносят только взвесь микробов и комплемент. Затем во все пробирки добавляют изотонический раствор хлорида натрия, доводя объем до 2 мл.

Пробирки помещают в термостат при температуре 37ОС на 2 часа. После инкубации производят высев из всех пробирок в чашки Петри с плотной питательной средой. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37ОС в

205

течение 18-24 часов и подсчитывают количество выросших колоний. Число выросших колоний из опытной пробирки должно быть в десятки и даже сотни раз меньше, чем из контрольных пробирок.