Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии

191

9.8. Реакция преципитации и ее варианты

Реакции преципитации (лат. praecipito – осаждать) основаны на феномене образования видимого осадка (преципитата) в растворе или в виде полос преципитации в геле после взаимодействия растворимых антигенов (преципитиногенов) со специфическими антителами (преципитинами). Реакции преципитации проводят в пробирках, в агаре, в гелях. Гелевой основой служат агар, агароза, карбоксиметилцеллюлоза и другие соединения. В качестве реагентов в реакциях преципитации используют гипериммунные преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител к гомологичным антигенам.

Выделяют следующие наиболее распространенные разновидности реакции преципитации:

-реакция кольцепреципитации;

-реакции преципитации в геле (реакция простой иммунодиффузии, реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини и реакция встречной иммунодиффузии по Оухтерлони);

-иммуноэлектрофорез;

-реакция флоккуляции.

9.8.1.Реакция кольцепреципитации

Реакцию кольцепреципитации проводят в специальных узких преципитационных пробирках (диаметр 0,4-0,5 см, высота 7-8 см). В пробирку вносят 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем на слой сыворотки осторожно по стенке пробирки в наклонном положении наслаивают такое же количество жидкости, содержащей растворимый антиген. После этого пробирку осторожно ставят вертикально в штатив. Через несколько секунд наблюдают образование белого кольца преципитата (рисунок 196).

Рисунок 196 – Схема постановки и результат реакции кольцепреципитации. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

192

экстрагированные кипячением из различного сельскохозяйственного сырья и объектов внешней среды (органы животных, шкуры, шерсть, войлок, мясо, почва и др.). Для постановки этой реакции готовят экстракт антигена из исследуемого материала: исследуемый материал кипятят в изотоническом растворе хлорида натрия в соотношении 1:10 в течение 5-10 минут или экстрагируют антиген карболовой или уксусной кислотой. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр или асбестовую вату или центрифугируют при 1000-3000 об/мин. В узкую пробирку для преципитации вносят 0,2-0,3 мл иммунной преципитирующей противосибиреязвенной сыворотки и осторожно наслаивают на нее 0,2-0,3 мл испытуемого экстракта. В течение 10 минут на границе между сывороткой и экстрактом в положительных случаях появляется кольцо помутнения (кольцепреципитация).

Реакция кольцепреципитации также позволяет выявлять антитела к возбудителю бруцеллеза в молоке животных (кольцевая проба Банга). Сущность кольцевой пробы Банга состоит в том, что при наличии в молоке специфических антител происходит их связывание с окрашенным бруцеллезным антигеном и образование окрашенного кольца. При постановке этой пробы в пробирку с 2 мл молоком вносят 0,1 мл антигена (взвесь убитых бруцелл, окрашенных гематоксилином). Смесь энергично встряхивают и выдерживают при температуре 37-38ОС в течение 1 часа. При наличии в молоке специфических антител происходит связывание бактерий с антителами и образование темно-синего кольца в верхнем слое сливок. При отсутствии антител молоко гомогенно окрашивается в синий цвет, а слой сливок остается белым или слегка желтоватым (рисунок 197).

Рисунок 197 – Положительная (три пробирки слева) и отрицательная (три пробирки справа) кольцевая проба Банга на присутствие бруцелл в молоке. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Кольцевая проба Банга используется для проверки благополучия стада по бруцеллезу крупного рогатого скота и при исследовании молока на наличие бруцелл. Необходимо учитывать, что молоко вакцинированных коров также дает положительную пробу Банга.

193

9.8.2. Реакции преципитации в геле

Реакции преципитации в геле основаны на том, что антигены и антитела, встречаясь в геле, образуют видимые невооруженным глазом белые линии преципитата. Для приготовления геля используют агар или агарозу в количестве 1,5- 2,0%.

Различают следующие разновидности реакций преципитации в геле:

-реакция простой иммунодиффузии;

-реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини;

-реакция встречной иммунодиффузии по Оухтерлони.

Реакция простой иммунодиффузии (реакция диффузионной преципитации) используется в диагностике дифтерии. При диагностике дифтерии все изоляты возбудителя необходимо тестировать на способность продуцировать дифтерийный экзотоксин. Для этого используют реакцию преципитации в агаре (тест Илека или Элека). При проведении этой реакции на поверхность агара в чашке Петри помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической дифтерийной сывороткой. Вдоль полоски производят посевы исследуемых культур в виде макроколоний (бляшек). Между бляшками исследуемых культур высевают контрольный (лабораторный) заведомо токсигенный штамм возбудителя дифтерии. Через 24-48 часов инкубирования при температуре 37ОС между бляшками и полоской фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической сывороткой, образуются тонкие линии преципитации, свидетельствующие о продуцировании данной культурой дифтерийного экзотоксина (рисунок 198).

Рисунок 198 – Определение токсигенности C. diphtheriae in vitro методом иммунодиффузии. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини осуществляется следующим образом. Иммунную сыворотку смешивают с расплавленным агаровым гелем и наливают тонким слоем на стеклянную пластину или в чашку Петри. После застывания в геле делают лунки, в которые вносят антиген в разных разведениях. Антиген диффундирует в гель и формирует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена (рисунок 199).

194

Рисунок 199 – Схема реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Реакцию радиальной иммунодиффузии по Манчини используют для определения в сыворотках крови иммуноглобулинов разных классов, компонентов комплемента.

Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален количеству внесенного в лунки антигена. Количество антител устанавливают по калибровочной кривой.

Реакция встречной иммунодиффузии по Оухтерлони проводится на стеклянной пластинке. Для этого на пластинку наливают тонкий слой агарового геля и после застывания вырезают лунки. В одни лунки геля вносят антигены, а в другие лунки – иммунные сыворотки. Антигены и антитела диффундируют навстречу друг другу и в месте встречи образуют преципитат в виде белой полосы. У идентичных антигенов линии преципитата сливаются, а у неидентичных антигенов линии преципитации пересекаются (рисунок 200).

Антигены

Антитела

Рисунок 200 – Схема реакции встречной иммунодиффузии по Оухтерлони. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

195

9.9. Реакция нейтрализации токсина антитоксином с биопробой на белых мышах

Реакция нейтрализации токсина антитоксином с биопробой на белых мышах предназначалась для выявления ботулинического и столбнячного токсинов. Однако в настоящее время эти реакции в лабораторной клинической практике не используются. Вместо реакции нейтрализации токсина антитоксином с биопробой на белых мышах используют РНГА (см. раздел 9.3).

Для обнаружения ботулинических токсинов для каждой исследуемой пробы используют 4 белых мышей. Первое животное подкожно заражают только исследуемым материалом, а остальных мышей - смесью исследуемого материала с 200 МЕ антитоксической ботулинической диагностической сыворотки типов А, В и Е. Предварительно смеси выдерживают при комнатной температуре в течение 40 минут дня нейтрализации токсина антитоксином. Наблюдение за животными проводят в течение 4 дней. При наличии в материале токсина в течение 4-5 часов погибают все животные, кроме той мыши, которой была введена смесь токсина и гомологичной антитоксической сыворотки (рисунок 201).

Смеси исследуемого материала с антитоксическими сыворотками

Рисунок 201 – Схема постановки биопробы на белых мышах при диагностике ботулизма. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

При введении материала, содержащего ботулинический токсин, у мышей отмечается учащенное дыхание, полное расслабление мышц, развивается типичный симптом поражения - “осиная талия” и вытянутое в линию тело и хвост животного (рисунок 202).