Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии
206
10. Аллергологическая диагностика
Особое место в диагностике инфекционных болезней принадлежит внутрикожным пробам с бактериальными аллергенами. В таблице 23 представлены некоторые диагностикумы, применяемые в аллергологических исследованиях.
Таблица 23 – Диагностические внутрикожные пробы
Заболевание |
Диагностикум, |
Период острых |
Период |
|
|
проба |
|
проявлений |
реконвалесценции |
Бруцеллез |
Бруцеллин, |
проба |
++ |
++ |
|
Бюрне |
|
|
|
Туляремия |
Тулярин |
|
++ |
- |
Сибирская язва |
Антраксин |
|
+ |
++ |
Чума |
Пестин |
|
++ |
++ |
Туберкулез |
Туберкулин, |
проба |
+ |
+ |
|
Манту |
|
|
|
Сап |
Малеин |
|
++ |
++ |
Дизентерия |
Дизентерин, |
проба |
++ |
+ |
|
Цуверкалова |
|
|
|
Примечание: “+” - положительная реакция; “++” - резко положительная реакция; “-“ - отрицательная реакция.
Внутрикожные пробы в основном используются с диагностической целью. Они позволяют выявлять в организме антитела или сенсибилизированные к аллергену Т-лимфоциты. Кожно-аллергические реакции при инфекционных заболеваниях появляются с 4-5 дня болезни и достигают наибольшей интенсивности на 2-3 неделе болезни.
Аллерген вводят внутрикожно или наносят на скарифицированную кожу. У больного, сенсибилизированного к данному возбудителю, на месте введения аллергена через 24-48 часов развивается воспалительная реакция (положительный результат).
Проба Манту проводится путем внутрикожного введения туберкулина в объеме 0,1 мл. Туберкулин вводят строго внутрикожно на внутреннюю поверхность средней трети предплечья до образования “пуговки”. Суть реакции Манту состоит в том, что вводимые фрагменты микобактерий как бы притягивают к себе из кровеносных сосудов лимфоциты, уже встречавшиеся с туберкулезными бактериями. Чем больше в организме таких лимфоцитов, тем интенсивнее будет воспаление (положительная реакция). Результаты пробы учитывают через 48-72 часа по наличию индурации – очерченного или расплывчатого уплотнения тканей или образования папулы (рисунок 212).
Проба Манту оценивается следующим образом:
-отрицательная - наличие реакции от укола до 2 мм в диаметре;
-сомнительная - папула диаметром 2-4 мм или гиперемия;
207
-положительная - папула диаметром 5-17 мм у детей и подростков и 5-21
мму взрослых;
-гиперэргическая - папула диаметром более 17 мм у детей и подростков и более 21 мм у взрослых.
Рисунок 212 – Проведение пробы Манту и учет результатов. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Однако проба Манту дает положительную реакцию у людей, привитых вакциной БЦЖ. Кроме того, с помощью реакции Манту нельзя провести границу между инфицированием и латентной туберкулезной инфекцией (ЛТИ). Поэтому до последнего времени остается актуальным вопрос дифференцировки поствакцинальной (Mycobacterium bovis, штамм БЦЖ) и постинфекционной (Mycobacterium tuberculosis) чувствительности к туберкулину.
Определенную помощь в решение этого вопроса оказывает Диаскинтест. В основе этого теста лежит использование для внутрикожного введения синтетических белков, характерных исключительно для возбудителя туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis). Положительная проба Манту означает, что человек либо контактировал с возбудителем туберкулеза, либо недавно получил прививку БЦЖ, либо его организм инфицирован непатогенными микобактериями. Диаскинтест дает положительный результат только в том случае, когда человек инфицирован возбудителем туберкулеза или уже болеет туберкулезом (рисунок
213).
Рисунок 213 – Результаты Диаскинтеста через 72 часа. Заимствовано из Интернетресурсов.
208
Аллергеном для постановки пробы Бюрне служит бруцеллин, представляющий собой 0,1%-ный раствор полисахаридно-белкового комплекса, полученного из вакцинного штамма B. abortus 19-ВА. Применяется для выявления аллергической перестройки у инфицированных, больных, переболевших и лиц, вакцинированных против бруцеллеза. Вводится в дозе 0,1 мл внутрикожно в сгибательную поверхность предплечья. Реакция оценивается через 24 и 48 часов по размеру отека:
-диаметр отека 1-3 см – реакция слабо положительная;
-отек размером 3-6 см – умеренно выраженная реакция;
-отек более 6 см – сильно выраженная реакция.
Внутрикожное введение аллергена у больного бруцеллезом вызывает развитие местной реакции (отек, гиперемия, болезненность). Отрицательная проба Бюрне позволяет исключить бруцеллез. Положительная реакция Бюрне отмечается у больных и вакцинированных лиц (рисунок 214).
Рисунок 214 – Внутрикожная аллергическая проба Бюрне при бруцеллезе. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
209
11. Молекулярно-генетические методы исследования
Молекулярно-генетические методы исследования позволяют выявлять фрагменты генома возбудителя в исследуемом материале с помощью молекулярной гибридизации или полимеразной цепной реакции. Для молекулярно-генетических исследований используется такой же материал, как и для бактериологического исследования: клинический биологический материал от больного (кровь, смывы, соскобы, слюна, гной, мокрота, спинномозговая жидкость, желудочный сок, отделяемое из уретры, моча, испражнения, биоптаты тканей и органов), пробы из объектов внешней среды (пищевые продукты, вода, почва) и чистая культура микроорганизмов.
К молекулярно-генетическим методам исследования относятся:
-методы, основанные на изучении фрагментов ДНК (плазмидное типирование, рестрикционно-эндонуклеазный анализ);
-методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот (молекулярная гибридизация);
-методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК): полимеразная цепная реакция (ПЦР) и изотермальная амплификация (LAMP).
11.1.Плазмидное типирование
Плазмидное типирование заключается в том, что из бактерий с помощью специальных методов выделяют тотальную ДНК и разделяют ее путем электрофореза в агарозном геле. При этом выявляют наличие хромосомной и плазмидной ДНК. Присутствие в бактериальной клетке несколько разных плазмид позволяет при электрофорезе разделить их по молекулярной массе. Обработка плазмидной ДНК перед проведением электрофореза рестриктазами позволяет определить количество и размер образующихся рестрикционных фрагментов. Плазмидное типирование используется в эпидемиологических исследованиях при расследовании вспышек инфекционных заболеваний (рисунок 215).
Рисунок 215 - Установление идентичности Salmonella typhimurium, выделенных от разных пациентов, по присутствию в них одинаковых плазмид. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
210
11.2. Рестрикционно-эндонуклеазный анализ
Сущность рестрикционно-эндонуклеазного анализа заключается в обработке ДНК рестриктазами (эндонуклеазами), разрезающими молекулу ДНК по определенным последовательностям нуклеотидов. Рестрикционно-эндонуклеазный анализ (REA) предусматривает обработку рестриктазами ДНК бактериальной хромосомы. После разрезания ДНК проводят электрофорез в пульсирующем электрическом поле, в результате чего образующиеся фрагменты ДНК распределяются в зависимости от размера в уникальный видоспецифический профиль (рисунок 216). По сходству рестрикционных профилей изучаемого микроба и известных видов можно идентифицировать и типировать микроорганизмы.
Рисунок 216 – Пример рестрикционно-эндонуклеазного анализа бактерий. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
11.3. Молекулярная гибридизация
Молекулярная гибридизация основана на определении уникальных последовательностей генома микроорганизмов, отражающих свойства вида или варианта. Сущность обнаружения таких участков ДНК основана на способности комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот к гибридизации. В исследованиях используют меченые ферментом, радионуклидом или флюорохромом нуклеиновые зонды, представляющие однонитевые фрагменты ДНК, комплементарные уникальным участкам микробного генома. Образующиеся гибридные комплексы выявляются по изменению окраски реакционной смеси, флюоресценции или радионуклидным анализом.
Молекулярная гибридизация позволяет выявлять степень сходства двух молекул ДНК, что используется для эволюционного анализа, для идентификации и типирования микроорганизмов, а также для изучения экспрессии генов. В основном