Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии

176

При постановке РНГА для определения титра антител в сыворотке крови используют агглютинационные пробирки или полистироловые планшеты. С этой целью к разведениям сыворотки крови больного добавляют эритроцитарный антигенный диагностикум. При положительной реакции склеенные антителами эритроциты выпадают на дно в виде фестончатого осадка (“перевернутого зонтика”). При отрицательной реакции эритроциты оседают на дно в виде плотного осадка (“пуговки”). Результаты РНГА представлены на рисунке 180.

Рисунок 180 – Результат РНГА в планшетах при установлении титра антител в сыворотке крови больного. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Отличительные особенности осадка при положительной и отрицательной РНГА представлены на рисунке 181.

Рисунок 181 - Особенности осадка при положительной и отрицательной РНГА. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

177

РНГА используется с целью обнаружения ботулинического токсина в исследуемых пробах, например, в сыворотке крови больного. Возбудитель ботулизма вырабатывает токсины семи типов, однако чаще других у человека вызывают поражения токсины типов А, В и Е. Для постановки РНГА используют сыворотку больного и эритроциты, нагруженные антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В и Е (эритроцитарные антительные диагностикумы). В качестве контроля используют нормальную сыворотку крови. Схема РНГА представлена в таблице 21.

Таблица 21 – Постановка РНГА при диагностике ботулизма

Вположительном случае эритроциты оседают на дно лунки в виде зонтика,

апри отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки. Результаты реакции представлены на рисунке 182.

Рисунок 182 – Результаты РНГА при установлении типа ботулинического токсина. Номера лунок соответствуют номерам, представленным в таблице. Положительный результат в 3 лунке. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

РНГА при диагностике ботулизма исключает использование лабораторных животных (белых мышей), издавна используемых в установлении типа ботулинического токсина (реакция нейтрализации токсина в биопробе на лабораторных животных).

9.4. Реакция торможения гемагглютинации

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) широко используется при исследовании гемагглютинирующих вирусов. Она основана на том, что некоторые вирусы (в частности, вирусы гриппа) обладают гемагглютинирующей способностью за счет наличия у них гемагглютининов. При контакте таких вирусов с эритроцитами наступает гемагглютинация (рисунок 183).

178

Рисунок 183 – Реакция гемагглютинации (Воробьев А.А., Быков А.С., 2003).

При наличии в сыворотке крови соответствующих антител гомологичный вирус (антиген) связывается с этими антителами и утрачивает свою гемагглютинирующую активность, так как образуется комплекс антиген + антитело. В результате этого вирусы нейтрализуются антителами и теряют способность агглютинировать эритроциты. В РТГА эритроциты являются индикатором наличия вируса в смеси. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие в смеси свободного вируса, а отсутствие гемагглютинации (торможение гемагглютинации) - на нейтрализацию вируса антителами (рисунок 184).

Рисунок 184 – Схема реакции торможения гемагглютинации (Воробьев А.А., Быков А.С., 2003).

РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых могут агглютинировать эритроциты различных животных (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита).

РТГА ставят в пробирках (макрометод) или в специальных полистироловых планшетах (микрометод). РГТА позволяет обнаружить и определить титр антител в сыворотке крови больного с помощью известного вируса или идентифицировать неизвестный вирус путем постановки реакции с заведомо известными сыворотками (антителами).

Определение титра антител в сыворотке крови больного с помощью РТГА. Для постановки реакции используют пластиковые планшеты. В лунках готовят 2-кратные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,25 мл. Затем в лунки добавляют по 0,25 мл взвеси вируса и инкубируют 2 часа при температуре 37°С. Затем добавляют по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов, инкубируют еще 2 часа и оценивают результат по наличию гемагглютинации.

179

При положительной реакции (торможении гемагглютинации) образуется плотный осадок эритроцитов на дне лунки в виде “пуговки”. Отрицательная реакция (гемагглютинация) проявляется образованием фестончатого осадка в виде “зонтика”. Титр антител определяют по последней лунке с положительной РТГА (рисунок 185).

Рисунок 185 – Определение титра противовирусных антител с помощью РТГА. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Идентификация (типирование) вируса с помощью РТГА проводят с набором типоспецифических сывороток. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации.

Достоинства РТГА - простота техники постановки и быстрый результат. Однако эту реакцию можно использовать только для гемагглютинирующих вирусов.

9.5. Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА, enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) представляет собой метод, основанный на специфическом связывании антигена с антителом. При этом один из компонентов (антиген или антитело) конъюгирован (связан) с ферментом (так называемый конъюгат). В качестве маркировочных ферментов используют пероксидазу, щелочную фосфатазу или бетагалактозидазу. При добавлении в реакционную смесь хромогенного субстрата (вещества, меняющего цвет под влиянием фермента) образуется окрашенный продукт. В частности, при использовании пероксидазы среда окрашивается в желтокоричневый цвет, а при использовании щелочной фосфатаза – в желто-зеленый цвет. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител, что учитывается с помощью фотометра. При работе с тест-системами ИФА кроме фотометра используются термостат-встряхиватель (шейкер) и автоматический промыватель планшетов (вошер). Оборудование, используемое в ИФА, представлено на рисунке 186.

180

в

Рисунок 186 – Оборудование для ИФА: шейкер (а), вошер (б) и фотометр (в). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для осуществления этого анализа коммерческие фирмы выпускают наборы, в которых предварительно на твердом носителе (лунки пластикового планшета) сорбируют антигены (для выявления антител) или антитела (для выявления антигенов). Затем в лабораторных условиях в лунки добавляют остальные ингредиенты (сыворотку или антиген, конъюгат, субстрат). В положительном случае антитела соединяются с антигенами, ферменты разлагают субстрат и проявляются окрашенные продукты реакции (рисунок 187).

Методика постановки ИФА для определения антител. Исследуемый материал (сыворотка крови) вносят в лунки планшета, содержащие фиксированный антиген. Если в сыворотке присутствуют антитела к фиксированному на дне лунок антигену, после непродолжительной инкубации происходит их связывание. Затем лунки промывают буферным раствором, чтобы убрать несвязанные антитела, и добавляют конъюгат (антииммуноглобулины, меченные ферментом). При этом антииммуноглобулины связываются с искомыми иммуноглобулинами из исследуемой сыворотки (если таковые имелись, если нет – реакция дальше не протекает). Промывают лунки, чтобы убрать несвязанные антииммуноглобулины, и добавляют субстрат. После инкубирования учитывают результаты. Под действием фермента, конъюгированного на антииммуноглобулинах, происходит преобразование субстрата в цветной продукт, что сопровождается изменением окраски индикатора.