Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии

166

при 37ОС в течение 2-18 часов, затем в холодильнике в течение 6-20 часов. Истощаемая сыворотка после каждой адсорбции проверяется в реакции агглютинации на стекле как с культурами того вида, которыми ведется истощение, так и с родственными культурами.

Адсорбированные моновалентные (монорецепторные) сыворотки содержат антитела только к одному виду антигенов (рисунок 166).

Антитела А

Рисунок 166 – Метод адсорбции агглютиногенов по Кастеллани. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Полностью адсорбированные сыворотки освобождаются от микробных клеток путем центрифугирования. Затем к ней добавляют консервант и фильтруют через стерилизующий бактериальный фильтр. После выдерживания в течение 2 суток при комнатной температуре сыворотка проверяется на стерильность, специфичность и величину титра.

Агглютинирующие сыворотки наиболее широко применяются при диагностике заболеваний, вызываемых бактериями семейства Enterobacteriaceae. Например, при идентификации эшерихий используются поливалентные и типовые ОК-сыворотки. При дифференциации сальмонелл используют набор сывороток. В частности, агглютинирующая адсорбированная поливалентная сальмонеллезная О- сыворотка (групп А, В, С, Д, Е) предназначена для определения принадлежности к отдельным группам рода Salmonella. В случае положительного результата определяют серологическую группу отдельно с каждой сывороткой (входящей в смесь), а затем устанавливают серологический тип выделенного возбудителя с монорецепторными Н-сыворотками сальмонелл, входящих в данную группу.

Антигенные диагностикумы содержат известные антигены бактерий. Антигенные диагностикумы представляют собой инактивированные нагреванием или воздействием формалина цельные микробные клетки (корпускулярные антигены), или выделенные тем или иным способом и очищенные антигенные субстанции микробов (молекулярные антигены), сорбированные на частицах нейтрального носителя (эритроциты, латекс, целлюлоза и др.). Антигенные диагностикумы используются при постановке серологических реакций (прямых или непрямых). Они предназначены для определения антител к возбудителям инфекционных заболеваний в пробах сыворотки крови.

Для постановки ориентировочной реакции агглютинации при идентификации бактерий необходимо 3 компонента: антиген (агглютиноген, неизвестный микроб), антитело (агглютинин, диагностическая агглютинирующая сыворотка) и электролит

168

При определении антител в сыворотке крови с помощью известных антигенов можно использовать О-диагностикум и Н-диагностикум. О- диагностикум представляет собой взвесь бактерий, убитых нагреванием. Н- диагностикум представляет собой взвесь бактерий, убитых формалином. При обработке формалином сохраняется Н-антиген (жгутиковый антиген бактерий).

Разновидностями реакции агглютинации для выявления антител являются кровяно-капельная проба на туляремию и реакция Хаддльсона на бруцеллёз.

Кровяно-капельная проба на туляремию представляет собой реакцию агглютинации на стекле. В качестве антигена используют туляремийный диагностикум. При наличии у больного антител к возбудителю туляремии при смешивании сыворотки крови с антигеном на стекле немедленно наступает реакция агглютинации.

Реакция Хаддльсона на бруцеллёз представляет собой метод экспрессдиагностики бруцеллеза. Для проведения этой реакции каплю сыворотки крови помещают на предметное стекло и смешивается с бруцеллезным диагностикумом. В контроле капля сыворотки смешивается с физраствором. Положительная реакция проявляется образованием хлопьев (агглютината).

9.1.2. Развернутая реакция агглютинации

Развернутая реакция агглютинации может использоваться как для определения антител и установления их титров в сыворотке крови, так и для определения антигенов (возбудителя).

Для определения антител и их титров в сыворотке крови больного развернутую реакцию агглютинации проводят следующим образом. К серии разведений сыворотки крови добавляют антигенный диагностикум - взвесь известных убитых микроорганизмов или частицы с сорбированными на них известными антигенами. Максимальное разведение, дающее агглютинацию антигена, называют титром сыворотки крови. При постановке развернутой реакции агглютинации в ряд агглютинационных пробирок вносят по 1 мл физиологического раствора. В первую пробирку прибавляют равный объем исследуемой сыворотки крови. Готовят последовательные двукратные разведения сыворотки (титрование сыворотки), после чего в каждую пробирку вносят по 2 капли взвеси инактивированных бактерий (антигенный диагностикум), содержащей до 3 млрд. микробных тел в 1 мл. Пробирки помещают на 2 часа в термостат при температуре 37ОС. Реакция протекает с образованием мелких хлопьев, невидимых невооруженным глазом, поэтому учет результатов проводят под небольшим увеличением, используя для этого иногда специальный прибор –

агглютиноскоп (рисунок 169).

169

Рисунок 169 – Агглютиноскоп. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Интенсивность агглютинации учитывают по системе “четыре плюса”: полная агглютинация обозначается 4+, частичная агглютинация – 3+ или 2+, сомнительный результат - +. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. За титр антител в исследуемой сыворотке принимают последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация на 2+ (рисунок 170).

Рисунок 170 - Развернутая РА для определения титра антител в сыворотке крови. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

При определении возбудителя к разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. Положительная реакция проявляется образованием хлопьевидного осадка.

Реакцию агглютинации в пробирках (развернутую реакцию агглютинации) проводят для определения титра антител к возбудителям брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), бруцеллеза (реакции Райта).

Реакция Видаля предназначена для определения титра антител в сыворотке крови к возбудителям брюшного тифа и паратифов. Реакцию проводят следующим образом. Сыворотку крови разводят изотоническим раствором хлорида натрия (например, 1:20, 1:40, 1:80 и так далее). Затем к разведениям сыворотки крови добавляют О-диагностикум (культура бактерий, убитая спиртом или кипячением) или Н-диагностикум (культура бактерий, убитая формалином). Реакция Видаля с Viантигеном не используется, так как Vi-агглютинины появляются в сыворотке

170

больного нерегулярно и в невысоких титрах. Результаты Н-агглютинации учитываются через 2 часа инкубирования в термостате, а результаты О- агглютинации – через 2 часа пребывания в термостате и 18-24 часа – при комнатной температуре. Диагностическим титром реакции Видаля считают разведение сыворотки 1:200.

Реакция Райта предназначена для определения титра антител в сыворотке крови больных бруцеллезом. Сыворотку крови разводят изотоническим раствором хлорида натрия (например, 1:50, 1:100, 1:200 и так далее). К разведениям сыворотки крови добавляют единый бруцеллезный диагностикум (взвесь убитых бруцелл), содержащий в 1 мл 1 млрд. микробных клеток. Диагностическим считается титр выше 1:200.

9.1.3. Реакция коагглютинации

Реакция коагглютинации (РКоА) основана на способности белка А золотистого стафилококка неспецифически связывать Fc-фрагменты иммуноглобулинов, оставляя свободными их Fab-фрагменты. На этом принципе основано изготовление диагностикумов, состоящих из стафилококков с сорбированными на их поверхности известными антителами. При добавлении к такому диагностикуму соответствующих антигенов происходит их связывание с активными центрами антител (Fab-фрагментами). В результате такой коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и антигенов исследуемого микроба (рисунок 171).

Рисунок 171 – Схема реакции коагглютинации (Воробьев А.А. и др., 2006).

Реакцию коагглютинации используют для определения вида шигелл. Эту реакцию можно проводить уже на второй день исследования при наличии на среде с лактозой лактозонегативных колоний. С этой целью на типичную колонию наносят каплю суспензии белка А стафилококка, сенсибилизированного антителами против шигелл. Чашку осторожно покачивают и через 15 минут под микроскопом наблюдают появление агглютината.

Реакция коагглютинации используется также для идентификации холерных вибрионов. В этом случае она проводится на стекле с помощью диагностикумов, коагглютинирующих О1 и О139 холерные вибрионы. Эти