Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии

161

берут его пинцетом и прикасаются к поверхности предметного стекла (препаратотпечаток) или распределяют по стеклу тонким слоем.

После вскрытия труп животного утилизируют после автоклавирования. Все инструменты, кювету и доску для фиксации обрабатывают дезинфицирующими растворами или стерилизуют.

8.3. Определение вирулентности бактерий

При изучении свойств микроорганизмов в ряде случаев определяют их вирулентность. Это необходимо для характеристики возбудителей, выделенных от больных, бактерионосителей и из внешней среды, установления остаточной вирулентности живых вакцин, выявления напряженности иммунитета у животных и т. д.

Вирулентность выражают количественно в виде летальной или инфицирующей дозы:

-DLm (Dosis letalis minima) - минимальная летальная доза - минимальное количество возбудителя, вызывающее гибель 95% взятых в опыт лабораторных животных;

-DCL (dosis certae letalis) - абсолютно летальная доза - минимальное количество возбудителя, вызывающее гибель 100% взятых в опыт лабораторных животных;

-LD50 - минимальное количество возбудителя, вызывающее гибель 50% взятых в опыт лабораторных животных.

LD50 является более достоверным показателем вирулентности, так как в меньшей степени зависит от индивидуальной чувствительности животных. При

определении LD50 вид, пол, вес животных, условия содержания, кормления должны быть строго стандартизованными. Для определения LD50 из культуры бактерий готовят 10-кратные разведения, каждое из которых вводят не менее чем 5-10 животным. Через определенный промежуток времени отмечают количество погибших

животных в каждой группе и вычисляют LD50. Для вычисления LD50 существует несколько методов. Наиболее распространенным является расчет величины LD50 по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина по формуле:

lg LD50 = lgDmax – lgN·(ΣLi – 0,5), где

Dmax – максимальная из использованных доз; N – кратность разведения доз;

Li – отношение числа погибших от данной дозы животных к общему числу животных, которым была введена эта доза;

ΣLi – сумма отношений Li.

В настоящее время определение вирулентности бактерий проводят только в лабораториях научно-исследовательских организаций.

162

Многие патогенные свойства микроорганизмов коррелируют с легко выявляемыми in vitro фенотипическими признаками (маркерами вирулентности). Поэтому в ряде случаев для определения вирулентности достаточно обнаружить такие признаки у исследуемых культур. Так, у энтеропатогенных иерсиний (возбудителей иерсиниоза и псевдотуберкулеза) определяют кальций-зависимость роста при 37°С (на кальций-дефицитной среде), у возбудителей кишечных и мочевых эшерихиозов - соответствующие адгезины (в реакции агглютинации), у дифтерийной палочки - экзотоксин (в реакции иммунодиффузии) и т.д.

163

9. Иммунодиагностические реакции

Одним из широко применяемых в диагностике инфекций является серологический (лат. serum – сыворотка, logos – учение) метод, в основе которого лежит взаимодействие антигенов и антител. Этот метод позволяет выявлять неизвестные антигены микроорганизмов при взаимодействии с известными антителами или неизвестные антитела при взаимодействии с известными антигенами. Результатом взаимодействия антигенов и антител может быть образование осадка в результате склеивания частиц, лизис клеток, набухание капсул и др. Наибольшую ценность эти методы имеют в тех случаях, когда выделить возбудитель не представляется возможным, но можно определить наличие антигенов возбудителя.

В иммунологической диагностике применяют специфические препараты – диагностические сыворотки и диагностикумы.

Диагностические сыворотки представляют собой иммунные сыворотки, содержащие антитела известной специфичности в известном титре. Диагностические сыворотки получают путем иммунизации (гипериммунизации) животных соответствующими антигенами.

Диагностикумы представляют собой взвесь в физиологическом растворе известных микроорганизмов или извлеченных из них антигенов.

Иммунологическая диагностика инфекционных заболеваний проводится с целью обнаружения в сыворотке крови антител или для обнаружения в биологических жидкостях, в тканях или в пробах из внешней среды антигенов возбудителей.

Для иммунологического исследования используют сыворотки крови пациентов, чистые культуры микроорганизмов, выделенные от больного или из объектов внешней среды, патологический материал от больного (соскобы, пунктаты) для экспресс-обнаружения антигенов микроорганизмов.

Достоинства иммунологического исследования:

-высокая специфичность (способностью антигенов взаимодействовать только с гомологичными антителами);

-высокая чувствительность (реакция агглютинации выявляет 100 мг антител

в1 л, ИФА и РИА выявляют до 0,00001 мг антител в 1 л);

-возможность проведения ретроспективных эпидемиологических исследований на основании обнаружения антител;

-быстрота получения результатов (результаты при реакции агглютинации на стекле выявляются через 5 минут, результаты ИФА, РИА – через 4 часа, РП в геле – через 24 часа).

Выявление и идентификацию возбудителей по их антигенным свойствам проводят в реакциях агглютинации (ориентировочной агглютинации, коагглютинации, латексной агглютинации), преципитации и ее модификациях, иммунофлюоресценции (прямой или непрямой варианты).

Антитела к возбудителю определяют в таких серологических реакциях как развернутая реакция агглютинации, реакция непрямой гемагглютинации, реакция преципитации, реакция связывания комплемента, иммуноферментный анализ и др.

164

Широкое распространение в настоящее время в лабораторной практике получили методы латекс-агглютинации и серологические реакции с использованием метки (реакция иммунофлюоресценции - РИФ, иммуноферментный анализ - ИФА и иммуноблоттинг - ИБ).

9.1. Реакция агглютинации и ее разновидности

Реакция агглютинации (лат. agglutination – склеивание) позволяет выявлять корпускулярные антигены, то есть антигены, локализованные на поверхности крупных частиц (микроорганизмов, клеток различного происхождения, неорганических частиц). Механизм реакции агглютинации (РА) заключается в том, что антитело взаимодействует одним активным центром с антигенной детерминантой одной молекулы антигена, а другим активным центром - с антигенной детерминантой второй молекулы антигена. В результате подобного взаимодействия образуется агглютинат (рисунок 164).

Рисунок 164 – Варианты реакции агглютинации бактерий с различными антителами. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Реакция агглютинации проявляется склеиванием корпускулярных антигенов (агглютиногенов) с антителами (агглютининами) и реализуется в изотоническом растворе электролита, например в 0,9% растворе хлорида натрия. Реакция агглютинации проявляется выпадением осадка (агглютината). Реакция агглютинации проводится либо на стекле (ориентировочная или пластинчатая реакция агглютинации), либо в пробирках (развернутая реакция агглютинации).

9.1.1. Ориентировочная (пластинчатая) реакция агглютинации на стекле

Ориентировочная (пластинчатая) реакция агглютинации позволяет идентифицировать возбудителя с помощью известной сыворотки или определить антитела в сыворотке крови с помощью известных антигенов (бактерий). При определении возбудителя используют агглютинирующую диагностическую сыворотку, а при определении антител – антигенный диагностикум.

165

Диагностические агглютинирующие сыворотки содержат известные антитела. Их получают путем многократной иммунизации (гипериммунизации) лабораторных животных (чаще всего - кроликов) соответствующими антигенами. В качестве антигенов выступают либо целые микробные клетки, убитые нагреванием или обработкой формалином, либо очищенные отдельные антигены бактерий (О, К, Н). Для получения антитоксической диагностической сыворотки иммунизацию осуществляют соответствующим анатоксином. Гипериммунизацию животных проводят внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно взвесью убитых бактерий, начиная с дозы 200 млн., затем 500 млн., 1 млрд., 2 млрд. микробных тел в 1 мл, с интервалами 5 дней. Через 7-8 дней после последней инъекции у животных забирают кровь и определяют титр антител. Титром агглютинирующей сыворотки называется то максимальное разведение сыворотки, при котором происходит агглютинация с соответствующим антигеном.

После гипериммунизации сыворотка животных содержит антитела ко всем антигенам бактерий, поэтому ее называют “нативной” или “неадсорбированной” сывороткой (рисунок 165).

Антигены А В С

Нативная сыворотка Антитела А В С

Рисунок 165 – Получение нативной сыворотки. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Нативная сыворотка способна агглютинировать все бактерии той же группы (семейства, рода). Групповая агглютинация затрудняет определение вида выделенного микроба и серологическую диагностику заболевания. Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки обладают высоким титром - до

1:12800 - 1:25600.

Для выделения из нативной сыворотки антител к отдельным антигенам используют метод адсорбции по Кастеллани. Метод адсорбции по Кастеллани состоит в том, что при добавлении к нативной агглютинирующей сыворотке родственных бактерий происходит адсорбция (связывание) групповых антител при свободном состоянии видовых специфических антител. В зависимости от полноты истощения групповых агглютининов можно получить монорецепторные сыворотки (сыворотки, имеющие антитела только к одному антигену) или поливалентные сыворотки (сыворотки, дающие реакцию агглютинации с двумя - тремя родственными бактериями). В качестве адсорбента могут применяться живые или убитые бактерии. Наилучшей адсорбционной способностью обладает живая культура. Вначале нативная сыворотка выдерживается с адсорбентом в термостате