Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии

111

Система позволяет выполнять любой заданный рисунок посева. Рост изолированных колоний отмечается по ходу движения шарика (рисунок 108).

Рисунок 108 – Рост колоний по ходу движения металлического шарика. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

При выделении и культивировании некоторых бактерий применяют дополнительное воздействие физическими и химическими факторами. В частности, при выделении спорообразующих бактерий используют предварительное прогревание материала, йерсинии культивируют при пониженных температурах, для выделения кислотоустойчивых бактерий исследуемый материал обрабатывают кислотой для уничтожения некислотоустойчивых микробов. При выделении спорообразующих бактерий часто используют биопробу: прогретый исследуемый материал вводят подкожно лабораторным животным (белые мыши, морские свинки), после гибели животных производят вскрытие и посев из внутренних органов на питательные среды.

В случае природной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам, анилиновым красителям и другим химическим веществам эти соединения добавляют в питательные среды. Эти вещества, угнетая рост одних видов бактерий, не влияют на рост других. На этом принципе основано применение многих элективных сред с красителями: яично-крахмальные среды для выделения микобактерий туберкулеза, глюкозо-печеночная среда с генцианвиолетом (или кристаллвиолетом) для роста бруцелл и подавления роста других видов микроорганизмов.

Для выделения чистой культуры подвижных видов бактерий пользуются методом Мечникова и Шукевича. С этой целью каплю исследуемого материала наносят в нижнюю часть пробирки со скошенным агаром в конденсационную воду. При наличии в материале подвижного микроба через 12-18 часов на поверхности скошенного агара отмечается рост бактерий. Для пересева используют культуру с верхней части агара.

Выделение чистой культуры анаэробных бактерий имеет определенные особенности. Для культивирования анаэробных микроорганизмов применяют специальные среды: анаэробный кровяной агар с антибиотиками, тиогликолевую

112

полужидкую среду, жидкую среду Китта-Тароцци с кусочками мяса и слоем вазелинового масла на поверхности, среду Вильсона-Блера (железо-сульфитный агар) и др. Получить изолированные колонии в жидкой питательной среде невозможно, поэтому вначале используют посев материала штрихом на плотную питательную среду и культивирование посевов в анаэробных условиях (метод Цейсслера). В последующем для накопления чистой культуры анаэробов можно использовать жидкую питательную среду. Характер роста анаэробов в жидких питательных средах представлен на рисунках 109 и 110.

а б в Рисунок 109 – Рост клостридий на среде Китта-Тароцци: а – контроль, б, в - опыт.

Заимствовано из Интернет-ресурсов.

анаэробы

Рисунок 110 – Рост бактерий на тиогликолевой среде. Стрелками указаны зоны роста культуры. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

113

При выращивании анаэробных бактерий в высоком столбике агара можно разобщить микробные клетки и получить рост изолированных колоний в толще питательной среды. Для этого питательный агар разливают в пробирки, прогревают на кипящей водяной бане для удаления кислорода, после чего охлаждают до температуры 45°С, вносят исследуемый материал и тщательно перемешивают. После инкубирования в термостате в толще агара появляются изолированные колонии, для отбора которых столбик агара требуется перенести в чашку Петри и вырезать отдельную колонию (рисунок 111).

Рисунок 111 – Рост анаэробных бактерий в высоком столбике агара. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Исторический интерес представляют такие методы культивирования и получения изолированных колоний анаэробов как метод Вейнберга, метод Перетца, метод Виньяля-Вейона и др. Эти методы до сих пор описывают в учебной литературе. Однако они не используются в практической работе.

Метод Вейнберга заключается в посеве разведений материала в пробирки с расплавленным и остуженным сахарным агаром (рисунок 112).

Рисунок 112 – Получение изолированных колоний анаэробов по методу Вейнберга. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Метод Перетца представляет собой выращивание культуры в слое агара под стеклянной пластинкой, расположенной на двух стеклянных или деревянных палочках (рисунок 113).

114

Рисунок 113 – Метод Перетца. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Метод Виньяля-Вейона предусматривает выращивание культуры в 0,5% агаре в капилляре пастеровской пипетки.

Метод Аристовского представляет собой выращивание культуры в чашках Петри, помещенных в эксикатор с химическим поглотителем кислорода.

Метод “перевернутых чашек” заключается в выращивании культуры на агаре, разлитом в крышку чашки Петри. Сверху крышку закрывают стерильным донышком чашки, а щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином.

Метод Фортнера (биологический способ культивирования микробов) заключается в совместном культивировании в одной герметически закрытой чашке Петри аэробов и анаэробов. Пока в атмосфере присутствует кислород, растут аэробы, а при снижении концентрации кислорода начинается рост анаэробов (рисунок 114).

Рисунок 114 – Метод Фортнера. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в разных полях зрения обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Однако в случае выраженного плеоморфизма, присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры могут встречаться одновременно клетки с различной морфологией.

115

Культивирование микроорганизмов производят в специальных шкафах

– термостатах, в которых постоянно поддерживается необходимая температура. Лабораторный термостат представляет собой шкаф, имеющий снаружи слой теплоизоляционного материала. Термостаты бывают водяные и суховоздушные. В настоящее время наиболее распространенными являются суховоздушные термостаты. Внутри термостатов располагаются сетчатые полки для размещения посевов. Температуру в термостате поддерживают с помощью автоматических терморегуляторов. Внешний вид термостата представлен на рисунке 115.

Рисунок 115 – Лабораторный термостат. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для большинства бактерий оптимальная температура выращивания составляет 36-37ОС. В лабораториях, где проводится большой объем работы, оборудуются специальные термальные комнаты, оснащенные нагревателями.

Признаки роста бактериальных клеток в жидких и на плотных питательных средах характеризуют культуральные свойства микроорганизмов.

В жидкой питательной среде рост микроорганизмов проявляется либо равномерным помутнением среды (диффузный рост культуры), либо образованием осадка (придонный рост культуры), либо формированием пленки на поверхности среды.

Осадок может быть рыхлый, легко разбивающийся при встряхивании пробирки, слизистый, поднимающийся в виде “косички”, либо в виде сплошной массы на дне пробирки. Для некоторых микроорганизмов характерен особый вид осадка. Например, сибиреязвенный микроб формирует осадок в виде нежного комочка ваты.

Пленка на поверхности питательной среды может быть сухой и слизистой, гладкой и складчатой. Для возбудителя туберкулеза характерно образование грубой морщинистой пленки на поверхности среды со свисающими вниз косичками. В ряде случаев бактериальные культуры дают одновременно помутнение среды, обильный осадок и пристеночное кольцо на поверхности.

На плотной питательной среде культуральные свойства определяют по характеру развивающихся колоний. При внесении на поверхность среды большого