Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии
116
количества микробных клеток наблюдают сплошной рост бактерий в виде газона. При небольшой концентрации клеток образуются изолированные колонии.
Выросшие изолированные колонии характеризуют по величине, форме, контуру края, рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции. Величина колоний определяется по ее диаметру. Различают точечные (диаметр менее 1 мм), мелкие (диаметр 1-2 мм), средние (диаметр 2-4 мм) и крупные (диаметр 4-6 мм и более) колонии. По форме колонии бывают правильными (круглая форма), неправильными (амебовидная форма), ризоидными (корневидная форма). Характер контура края определяют при рассмотрении колонии под лупой или под микроскопом при малом увеличении. Различают ровные и неровные края колоний. Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Поверхность колонии бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth - гладкий), шероховатые - буквой R (rough – шероховатый). Цвет колоний определяется пигментом, продуцирующим микробом. Большинство патогенных бактерий пигмента не образуют, поэтому их колонии бесцветны или серовато-белого цвета. Пигментообразующие бактерии формируют кремовые, желтые, синие, красные колонии. Консистенцию колонии определяют при взятии из нее части материала бактериальной петлей. Различают вязкие или слизистые колонии, прилипающие и тянущиеся за петлей. Признаки колоний представлены на рисунке 116.
Форма
|
Округлая |
Неправильная Веретенообразная |
|
|
|
Точечная |
Волокнистая |
Ризоидная |
|
Профиль
Плоский |
|
Выпуклый |
Пуповидный |
|
Приподнятый |
Подушкообразный |
|
|
|
||
Край
Гладкий |
Дольчатый |
Волокнистый |
||
|
Волнистый |
Эрозированный |
Складчатый |
|
Рисунок 116 – Признаки колоний микроорганизмов. Заимствовано из Интернетресурсов.
К микроорганизмам, продуцирующим пигменты, относятся Staphylococcus aureus (оранжево-желтый пигмент), Pseudomonas aeruginosa (сине-зеленый пигмент), Serratia marcescens (оранжево-красный пигмент), Peptostreptococcus niger
(коричнево-черный пигмент) и другие бактерии (рисунок 117).
117
а б
Рисунок 117 – Пигментообразующие бактерии: а - Pseudomonas aeruginosa; б - Serratia marcescens. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Несмотря на большое количество признаков, по которым различаются колонии разных видов бактерий, в практической работе используют следующие основные морфотипы колоний:
-колонии S-формы (англ. smooth – гладкий) имеют ровные края и гладкую поверхность;
-колонии R-формы (англ. rough – шероховатый) имеют изрезанный край, шероховатую поверхность;
-колонии М-формы (англ. mucus – слизистый) имеют слизистую или мукоидную консистенцию.
Под действием некоторых факторов (химиопрепаратов, факторов макроорганизма и др.) у бактерий может отмечаться переход от S-формы в R-форму. Такое явление называется диссоциацией.
При наличии в исследуемом материале большого количества микробов на плотной питательной среде бактерии растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность среды. Такой характер роста называется газоном. Посев газоном проводят для получения большого количества чистой культуры бактерий.
При необходимости чашки с посевами просматривают с помощью лупы или микроскопа при малом увеличении. В случае наличия нескольких типов колоний каждый исследуется в отдельности. Для определения тинкториальных свойств из части колонии готовят мазок, окрашивают по Граму или другими методами и микроскопируют. Другую часть колонии используют для посева штрихом на скошенный агар в пробирки с целью получения чистой культуры. Посевы инкубируют в термостате при 37ОС. Такая температура является оптимальной для большинства микроорганизмов.
5.2.4.Биохимическая идентификация бактерий
При культуральном исследовании для установления родовой и видовой принадлежности бактерий определяют характер роста культуры в жидких и на
118
плотных питательных средах (культуральные признаки), разложение углеводов (сахаролитические или гликолитические свойства), белков (протеолитические свойства) и липидов (липолитические свойства), чувствительность к бактериофагам и антибиотикам, бактериоциночувствительность, токсигенность и другие признаки. Окончательная идентификация чистой культуры основывается на изучении биохимических, генетических, серологических и биологических признаков (таблица
16).
Таблица 16 – Признаки, учитываемые при идентификации бактерий (критерии вида)
Признаки |
Характеристика признаков |
Морфологические |
Размеры клеток |
|
Форма клеток |
|
Взаимное расположение клеток |
Тинкториальные |
Окраска по Граму |
|
Окраска дифференциально-диагностическими методами |
Культуральные |
Вид колоний на плотной питательной среде |
|
Характер роста культуры в жидкой среде |
Биохимические |
Разложение белков (выявление протеаз) |
|
Разложение углеводов (выявление карбогидраз) |
|
Разложение липидов (выявление липаз) |
|
Выявление оксидоредуктаз (оксидазы, каталазы, дегидразы) |
|
Выявление ферментов агрессии (лецитиназы, |
|
плазмокоагулазы, ДНКазы, гиалуронидазы) |
|
Выявление экзотоксинов (дифтерийного, гемолизина) |
|
Определение профиля летучих жирных кислот для |
|
анаэробов |
Генетические |
Содержание Г+Ц-пар в ДНК |
|
Последовательность нуклеотидов в ДНК |
Серологические |
Антигенная структура микроба |
|
Серовары бактерий |
Биологические |
Вирулентность для животных |
|
Токсигенность |
|
Чувствительность к бактериофагам (определение фаговара) |
|
Чувствительность к антибиотикам |
Биохимическая идентификация бактерий основана на выявлении определенных ферментов по способности разлагать те или иные субстраты. Для такой идентификации требуется чистая культура бактерий. Получение чистой культуры бактерий продолжается в течение 2 суток. Процесс биохимической идентификации чистой культуры занимает в среднем 18-24 часа. Таким образом, результат идентификации возможен, в крайнем случае, через 3 суток. При биохимической идентификации выявляют ферменты, разлагающие углеводы (сахаролитические ферменты), белки (протеолитические ферменты), липиды (липолитические ферменты), окислительно-восстановительные ферменты. Дополнительно на соответствующих питательных средах можно определить наличие ферментов – токсинов (гемолизина, плазмокоагулазы и др.).
119
Согласно международной биохимической классификации в зависимости от катализируемой реакции выделяют 6 основных классов ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Отдельные представители каждого класса ферментов имеют систематическое название, а также четырехуровневый числовой код, который отражает класс, подкласс, под-подкласс и серийный номер фермента в под-подклассе. Кроме систематического названия ферменты микроорганизмов в зависимости от субстратной специфичности имеют традиционные (тривиальные) названия: сахаролитические, протеолитические, липолитические, окислительно-восстановительные ферменты, а также ферментытоксины, которые определяют с помощью специальных сред или тестов. Возможности биохимической идентификации бактерий на питательных средах представлены в таблице 17.
Таблица 17 – Биохимическая идентификация бактерий
Группа |
Название |
Питательная среда для |
Реакция на присутствие |
выявляемых |
ферментов |
выявления ферментов |
ферментов |
ферментов |
|
|
|
Сахаролитические |
Амилаза |
Агар с 0,2% крахмала |
Нанесение раствора йода на |
ферменты |
|
|
18-24 часовую культуру |
|
|
|
бактерий при наличии амилазы |
|
|
|
вокруг колоний формируется |
|
|
|
светлый ореол при сине- |
|
|
|
фиолетовой окраске остальной |
|
|
|
части среды |
|
Карбогидразы |
Среды с лактозой и |
Лактозоположительные |
|
|
анилиновыми |
энтеробактерии (E. coli, K. |
|
|
красителями (Эндо, |
oxytoca, K. pneumonia), |
|
|
Левина, Плоскирева) |
образуют ярко окрашенные |
|
|
|
темные колонии, |
|
|
|
лактозоотрицательные |
|
|
|
энтеробактерии (Salmonella, |
|
|
|
Shigella) – бледно-розовые или |
|
|
|
бесцветные колонии |
|
|
Жидкие или полужидкие |
При разложении углеводов |
|
|
моноуглеводные среды |
образуются кислые продукты, |
|
|
Гисса; содержат один из |
снижающие рН среды, в |
|
|
углеводов и индикатор |
результате чего индикатор рН |
|
|
рН. Для выявления |
изменяет цвет. Газы, |
|
|
газообразования в |
образующиеся в жидких |
|
|
жидкие среды вносят |
средах, накапливаются в |
|
|
поплавок |
поплавке, в полужидких средах |
|
|
|
газы разрывают среду или |
|
|
|
накапливаются в виде |
|
|
|
пузырьков в среде |
Протеолитические |
Протеазы и |
5% обезжиренное |
Свёртывание молока с |
ферменты |
пептидазы |
молоко |
образованием сгустков казеина |
|
|
|
и пептонизация |
|
|
Свёрнутая сыворотка |
Разжижение сгустка |
|
|
Столбик желатина |
Разжижение желатина |
|
|
Молочный агар |
Зоны просветления вокруг |
120
|
|
|
колоний на фоне мутно-белой |
|
|
|
среды |
|
Дезаминазы |
Среда с одной из |
Образование аммиака |
|
аминокислот |
аминокислот и |
приводит к защелачиванию |
|
|
индикатором рН |
среды и изменению цвета |
|
|
|
индикатора |
|
Декарбоксилазы |
Среда с одной из |
При образовании диаминов |
|
|
основных аминокислот |
среда подщелачивается, что |
|
|
(аргинином, лизином, |
вызывает изменение цвета |
|
|
орнитином, гистидином, |
индикатора |
|
|
тирозином, глутамином) |
|
|
|
и индикатором рН |
|
|
Триптофаназа |
Мясопептонный бульон |
Образование индола приводит |
|
|
или среда с |
к покраснению индикаторной |
|
|
триптофаном, а также |
бумажки |
|
|
индикаторная бумажка, |
|
|
|
смоченная щавелевой |
|
|
|
кислотой и закреплённая |
|
|
|
под пробкой над |
|
|
|
питательной средой |
|
|
Десульфуразы |
Среды с цистеином, |
Образующийся сероводород |
|
(цистиназы) |
метионином и |
взаимодействует с |
|
|
реактивом на |
индикатором с образованием |
|
|
сероводород |
сульфида железа, что вызывает |
|
|
|
почернение среды |
|
Уреаза |
Среда с мочевиной и |
Образование аммиака |
|
|
индикатором рН |
приводит к изменению окраски |
|
|
феноловым красным |
среды из красно-оранжевой в |
|
|
|
малиново-лиловую |
Липолитические |
Липаза |
Желточный агар или |
Вокруг колоний образуется |
ферменты |
|
среда с твином-80 |
радужный ореол |
|
Лецитиназа |
Желточный агар (агар с |
Вокруг колоний появляется |
|
|
куриным желтком) |
опалесцирующая зона |
|
|
|
(венчики помутнения) |
Окислительно- |
Оксидаза |
Фильтровальная бумага, |
При нанесении петлей 18-24 |
восстановительные |
|
смоченная 1% |
часовой культуры на |
ферменты |
|
раствором |
поверхность фильтровальной |
|
|
тетраметилпарафенилен- |
бумаги в течение 1 минуты |
|
|
диамина (реактив на |
появляется пурпурно- |
|
|
оксидазу) |
фиолетовое окрашивание |
|
Каталаза |
3% раствор Н2О2 |
При нанесении перекиси |
|
|
|
водорода на культуру в чашке |
|
|
|
Петри или при внесении |
|
|
|
культуры в каплю перекиси на |
|
|
|
предметном стекле появляются |
|
|
|
пузырьки газа (тест не |
|
|
|
используется на кровяных |
|
|
|
средах) |
|
Дегидразы |
Сахарный полужидкий |
Образующиеся дегидразы |
|
|
агар с 1% метиленовым |
обесцвечивают метиленовый |
|
|
синим |
синий |
|
Пероксидаза |
Бензидиновый тест: на |
При наличии пероксидазы |
|
|
предметное стекло |
бесцветная среда приобретает |