Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии
|
|
|
121 |
|
|
наносят суточную |
розовую или вишнёво-красную |
|
|
бактериальную |
окраску |
|
|
культуру, раствор |
|
|
|
метилпарааминофенол- |
|
|
|
сульфата и раствор |
|
|
|
перекиси водорода |
|
Ферменты - |
Гемолизины |
Кровяной агар |
α-гемолизины приводят к |
токсины |
|
|
неполному гемолизу с |
|
|
|
образованием вокруг колоний |
|
|
|
зоны неполного просветления |
|
|
|
среды с зеленовато-бурым |
|
|
|
оттенком; β-гемолизины |
|
|
|
вызывают полный гемолиз с |
|
|
|
образованием прозрачной зоны |
|
|
|
вокруг колоний; γ-гемолизины |
|
|
|
не дают гемолиза |
|
О-стрептолизин |
К жидкой культуре |
При наличии О-стрептолизина |
|
|
добавляют эритроциты |
происходит гемолиз |
|
|
кролика |
эритроцитов (лаковая кровь), |
|
|
|
при отсутствии О- |
|
|
|
стрептолизина эритроциты |
|
|
|
выпадают в осадок |
|
Плазмокоагулаза |
Стерильная цитратная |
После внесения суточной |
|
|
плазма крови в |
культуры и 5 часов инкубации |
|
|
пробирках |
в термостате происходит |
|
|
|
свёртывание плазмы |
|
Фибринолизин |
Сгустки фибрина |
Растворение сгустков фибрина |
Для идентификации выделенных культур по биохимическим свойствам в состав питательных сред вводят дифференцирующие субстраты и соответствующие индикаторы. В качестве субстратов используют углеводы (глюкоза, сахароза, лактоза и др.), белки, липиды, мочевину и другие соединения. При расщеплении субстратов изменяется рН среды или окислительно-восстановительный потенциал среды. В результате этого индикатор изменяет цвет среды или вокруг колоний бактерий формируются специфические зоны расщепления субстратов.
Для определения пути расщепления глюкозы (окислительный или бродильный) проводят тест ОФ (тест окисления/ферментации): культуру высевают уколом в две пробирки с полужидкой питательной средой, содержащей глюкозу и бромтимоловый синий. Исходный цвет среды – зеленый. В одну из пробирок после посева наносят слой вазелинового масла (для создания анаэробных условий). Обе пробирки инкубируют при температуре 37°С. Изменение цвета среды на желтый в обеих пробирках свидетельствует о ферментации глюкозы. Изменение цвета среды только в пробирке без масла свидетельствует об утилизации глюкозы путем окисления. Отсутствие кислотообразования в обеих пробирках и сохранение исходного цвета свидетельствует о том, что тестируемые микроорганизмы не утилизируют глюкозу ферментацией и окислением. В этом случае микроорганизмы могут относиться к неферментирующим видам (рисунок 118).
122
К1 К2 а б в г д е
Рисунок 118 – Рост псевдомонад (а, б) и эшерихий (в-е) на среде ХьюЛейфсона в аэробных (без масла) и анаэробных (с маслом) условиях (тест ОФ). К1 и К2 – контрольные среды для анаэробных и аэробных условий (Воробьев А.А. и др.,
2006).
Для определения каталазы на поверхность суточной культуры на питательном агаре наносят несколько капель 3% раствора перекиси водорода (нельзя использовать кровяной агар, так как каталаза эритроцитов может дать
ест на каталазу
Выявление каталазы
–
ющий
и |
|
|
а |
|
б |
8 |
|
|
|
|
|
|
|
. |
Рисунок 119 – Определение каталазы на предметном стекле (а) и на питательном |
|||||
|
|
агаре (б). Заимствовано из Интернет-ресурсов. |
|
|||
ть |
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
ожно по |
Для |
выявления микробной нитратредуктазы ставят тест на |
||||
|
восстановление нитрата в нитрит (последний в присутствии N,N-диметил-1- |
|||||
|
нафтиламина образует диазосоединение, которое окрашивает среду в красный цвет). |
|||||
, которые |
|
|
|
|
||
|
Культуру выращивают на полужидкой среде, содержащей 0,1% нитрата, и |
|||||
|
добавляют смесь указанного реактива с сульфаниловой кислотой, наблюдая в |
|||||
|
течение нескольких минут за развитием красного окрашивания |
среды (сви- |
||||
ся после |
|
|
|
|
|
|
|
детельствует о присутствии нитрита). |
7 |
|
|
||
одорода |
|
|
|
|
|
|
нием |
|
|
|
|
|
|
ия |
|
Для |
выявления цитохромоксидазы |
используют слайды, |
содержащие |
|
|
|
|
|
|
|
|
реактив Ковача (N, N-диметил-n-фенилендиамин). При нанесении культуры в случае
х клеток с
положительной реакции слайд меняет цвет на темно-фиолетовый (рисунок 120).
ром одорода.
ьно-
реакцию - |
|
|
|
|
|
|
|
|
123 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
лекулы |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ется кислород. |
|
|
|
|
|
|
|
|||
дазу |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
смачиванием |
|
|
|
|
|
|
|
|
||
альным |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
спиртовый |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ола; 1% водный |
|
|
|
|
|
|
|
|||
тил-β- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Рисунок 120 – Определение цитохромоксидазы с реактивом Ковача. Заимствовано из |
|||||||||
на |
|
|
|
|
|
Интернет-ресурсов. |
|
|
||
а). Нанесение на |
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
Определение цитохромоксидазы возможно также другим способом. На |
|||||||||
суточной |
чашки |
Петри |
наносят |
крупную 9 каплю реактива |
Ковача на |
|||||
|
поверхность |
|||||||||
рий приводит к |
из |
флакона. Запаянным концом пастеровской пипетки |
||||||||
его |
цитохромоксидазу |
|||||||||
перемещают |
в |
каплю |
реактива |
часть |
исследуемой культуры. |
Учет |
результатов |
|||
спользуют |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
проводят через |
1 |
минуту. |
При |
наличии цитохромоксидазы |
комочек бактерий |
||||
|
окрашивается в фиолетовый цвет, при отсутствии цитохромоксидазы окраска |
|||||||||
ные слайды. |
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
культуры не изменяется. |
|
|
|
|
|
||||
|
Способность бактерий расщеплять углеводы называется сахаролитической |
|||||||||
|
активностью бактерий. При расщеплении бактериями углеводов образуется кислота |
|||||||||
|
(молочная, уксусная, муравьиная) или кислота и газ (углекислый газ, водород). |
|||||||||
|
Поэтому по образованию конечных продуктов расщепления углеводов судят о |
|||||||||
|
спектре гликолитической активности бактерий. |
|
|
|||||||
|
Для выявления гликозидаз используют жидкие или полужидкие среды Гисса |
|||||||||
|
(“пестрый ряд”). Жидкие среды Гисса представляют собой пептонную воду, |
|||||||||
|
содержащую один из углеводов (лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и т. д.) и |
|||||||||
|
индикатор Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). Для улавливания |
|||||||||
|
образующихся газов в пробирку помещают поплавок или “газовку” (микропробирку |
|||||||||
|
вверх дном). Во время стерилизации поплавок заполняется средой. Исходный цвет |
|||||||||
|
среды – соломенно-желтый. При расщеплении углевода до кислоты наблюдается |
|||||||||
|
только изменение цвета среды на красный, а при образовании еще и газа последний |
|||||||||
|
скапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется. |
|||||||||
|
Полужидкие среды Гисса содержат 0,2-0,5% МПА, 1% одного из углеводов |
|||||||||
|
и индикатор ВР (смесь водного голубого и розоловой кислоты). Исходный цвет |
|||||||||
|
среды – розово-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а |
|||||||||
|
при образовании газа отмечаются разрывы среды или пузырьки газа в толще среды. |
|||||||||
|
Каждый вид бактерий ферментирует только определенный спектр углеводов, |
|||||||||
|
поэтому в одних пробирках цвет среды меняется, а в других – остается исходным. |
|||||||||
|
Поэтому набор пробирок со средами для выявления спектра сахаролитических |
|||||||||
|
свойств и называют “пестрым рядом”. Это позволяет отличить один вид бактерий от |
|||||||||
|
другого. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Протеолитическую активность бактерий выявляют при посеве чистой |
|||||||||
|
культуры на специальные питательные среды (мясопептонный желатин - МПЖ, |
|||||||||
|
молочный агар, |
мясопептонный |
бульон, свернутая сыворотка |
крови). Результат |
||||||
|
|
|
|
|
124 |
|
оценивают по разжижению желатина, разложению казеина молока вокруг |
||||
|
колоний или по конечным продуктам распада белков. Протеолитическая активность |
||||
|
Изучение протеолитических |
|
разных питательных |
||
|
свойств по способности |
|
зжижения желатина: |
||
|
|
|
|
|
|
|
разжижать желатин |
вибрион – в виде гвоздя |
|||
|
|
|
|||
• |
Разные виды |
|
|
|
|
|
бактерий имеют |
|
|
|
|
|
разную форму |
|
|
|
|
|
разжижения |
|
|
|
|
|
желатина; S. aureus – |
|
|
|
|
|
в виде воронки; B. |
|
|
|
|
|
antracis – в виде |
|
|
|
|
|
опрокинутой |
|
|
|
|
|
елочки; Vibrio |
|
|
|
|
|
cholerae – в виде |
|
|
|
|
|
Рисунок 121 – Характер разжижения желатина разными бактериями. Заимствовано |
||||
|
гвоздя и т.д. |
|
из Интернет-ресурсов. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Разжижают желатин |
действие ферментов микроорганизмов можно наблюдать |
|||
|
бактерииПротеолитическое, имеющие |
||||
|
|
|
18 |
|
|
|
ферментпри посевах бактерий на свернутую сыворотку, при этом вокруг колоний |
||||
|
коллагеназунаблюдается разжижение среды. |
|
|
||
|
Способность микробов гидролизовать казеин определяют на молочном |
||||
|
агаре Эйкмана (10 мл стерильного расплавленного МПА и 3 мл обезжиренного |
||||
|
стерильного |
молока). Посев производят таким образом, чтобы получить |
|||
|
изолированные |
Протеолиз казеина |
|
24-48 часов. |
|
|
|
|
|||
|
Протеолиз |
(выращивание на молочном |
вокруг колоний |
||
|
прозрачной зоны |
агаре) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Рисунок 122 – Протеолиз казеина. Заимствовано из Интернет21 |
-ресурсов. |
При посеве в жидкое молоко протеолиз выражается просветлением столбика молока, водянистым содержимым и слизистым осадком на дне.
Конечными продуктами распада белков могут быть индол, сероводород и аммиак. Для обнаружения этих газообразных продуктов используют индикаторные бумажки, которые помещают внутрь пробирки между стенкой пробирки и ватномарлевой пробкой. Индикатором на индол (продукт разложения триптофана)
125
является щавелевая кислота. Пропитанная щавелевой кислотой бумажка при наличии индола меняет белый цвет на розовый. Тестирование культур на образование индола проводят также с помощью реактива Ковача или реактива
Эрлиха. Основой этих реактивов |
Тест на индол |
. При |
положительной реакции наблюдается |
|
|
|
|
а б Рисунок 123 – Тест на индол с помощью индикаторных полосок
Ковача (б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
25
(а) и реактива
Индикатором на сероводород (продукт разложения серосодержащих аминокислот – цистина, цистеина, метионина) является ацетат свинца. При наличии
сероводорода |
образования сульфита |
свинца ( |
Тест на сероводород |
|
а |
б |
26 |
|
|
Рисунок 124 – Тест на сероводород: а – положительный тест; б – контроль. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Индикатором на аммиак (продукт разложения фенилаланина) является лакмусовая полоска бумаги. При наличии аммиака красная лакмусовая бумажка приобретает синий цвет.